Detectie van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van loop-gemedieerde isothermale versterking
Summary
We ontwikkelden een methode om Phytophthora capsici zoospores in waterbronnen te detecteren met behulp van een filter papier DNA-extractie methode in combinatie met een lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test die kan worden geanalyseerd in het veld of in het lab.
Abstract
Phytophthora capsici is een verwoestende oomycete ziekteverwekker die veel belangrijke solanaceous en cucurbit gewassen veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen in de plantaardige productie jaarlijks beïnvloedt. Phytophthora capsici is bodemgedragen en een hardnekkig probleem in groentevelden als gevolg van de langlevende overlevingsstructuren (oospores en chlamydosporen) die verwering en afbraak weerstaan. De belangrijkste methode van verspreiding is door de productie van zoösporen, die eencellige, gevlagde sporen die kunnen zwemmen door dunne films van water aanwezig op oppervlakken of in met water gevulde bodem poriën en kan zich ophopen in plassen en vijvers. Daarom kunnen irrigatievijvers een bron zijn van de ziekteverwekker en de eerste punten van ziekte-uitbraken. Detectie van P. capsici in irrigatiewater is moeilijk met behulp van traditionele cultuur gebaseerde methoden, omdat andere micro-organismen aanwezig in het milieu, zoals Pythium spp., meestal overwoekeren P. capsici waardoor het niet op te sporen. Om de aanwezigheid van P. capsici sporen in waterbronnen (irrigatiewater, afvloeiing, enz.) te bepalen, ontwikkelden we een handpompgebaseerde filterpapier (8-10 μm) methode die de sporen van de ziekteverwekker (zoösporen) vangt en later wordt gebruikt om het DNA van de ziekteverwekker te versterken door middel van een nieuwe lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) assay ontworpen voor de specifieke versterking van P capsici. Deze methode kan versterken en detecteren DNA uit een concentratie zo laag als 1,2 x 102 zoösporen / mL, dat is 40 keer gevoeliger dan conventionele PCR. Er werd geen kruisversterking verkregen bij het testen van nauw verwante soorten. LAMP werd ook uitgevoerd met behulp van een colorimetrische LAMP master mix kleurstof, het weergeven van resultaten die kunnen worden gelezen met het blote oog voor on-site snelle detectie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere ziekteverwekkers die zich bevinden, accumuleren of verspreid zijn via verontreinigde irrigatiesystemen.
Introduction
Het recyclen van water in boerderijen en kwekerijen wordt steeds populairder door de stijging van de waterkosten en de milieuproblemen achter het watergebruik. Er zijn veel irrigatiemethoden ontwikkeld voor telers om de verspreiding en het optreden van plantenziekten te verminderen. Ongeacht de bron van het water (irrigatie of neerslag), afvloeiing wordt gegenereerd, en veel groente-en kwekers hebben een vijver te verzamelen en te recyclen runoff1. Hierdoor ontstaat een reservoir voor mogelijke pathogene accumulatie ten gunste van de verspreiding van ziekteverwekkers wanneer het gerecycleerde water wordt gebruikt om gewassen te irrigeren2,3,4. Oomycete plant pathogenen in het bijzonder profiteren van deze praktijk als zoösporen zal zich ophopen in water en de primaire dispersieve spore is zelf-motile, maar vereist oppervlaktewater5,6,7. Phytophthora capsici is een oomycete pathogene die een aanzienlijk aantal solanaceous en cucurbit gewassen op verschillende manieren beïnvloedt8. Vaak zijn de symptomen demping-off van zaailingen, wortel en kroonrot; echter, in gewassen zoals komkommer, pompoen, meloen, pompoen, watermeloen, aubergine en peper, hele oogsten kunnen verloren gaan als gevolg van fruitrot9. Hoewel er bekende methoden zijn om deze plantenpathogen te detecteren, vereisen de meeste een infectie die al heeft plaatsgevonden, wat te laat is om preventieve fungiciden een significant effect te hebben10.
De traditionele methode om irrigatiewater te testen op de detectie en diagnose van gerichte micro-organismen is een verouderde aanpak wanneer snelheid en gevoeligheid cruciaal zijn voor succes en winstgevende gewasproductie11,12. Plantweefsel dat gevoelig is voor de beoogde ziekteverwekker (bijvoorbeeld aubergine voor P. capsici)is bevestigd aan een gemodificeerde val die gedurende langere tijd in een irrigatievijver wordt opgehangen voordat het wordt verwijderd en gecontroleerd op infectie. Monsters van het plantenweefsel worden vervolgens verguld op semi-selectieve media (PARPH) en geïncubeerd voor groei van de cultuur, dan morfologische identificatie wordt uitgevoerd met behulp van een samengestelde microscoop13. Er zijn andere soortgelijke detectiemethoden voor andere plantpathogenen met behulp van selectieve media en plating kleine hoeveelheden verontreinigd water voor sub-culturing14,15. Deze methoden vereisen overal van 2 tot 6 weken, verschillende rondes van sub-culturing om het organisme te isoleren, en ervaring op Phytophthora diagnostiek te kunnen de belangrijkste morfologische kenmerken van elke soort te herkennen. Deze traditionele methoden werken niet goed voor de detectie van irrigatiewater besmet door P. capsici als gevolg van factoren zoals interferentie door andere micro-organismen die ook aanwezig zijn in de waterbronnen. Sommige snelgroeiende micro-organismen zoals Pythium spp. en door water overgedragen bacteriën kunnen overwoekeren op de plaat waardoor P. capsici niet op te sporen16,17.
Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een gevoelige en specifieke moleculaire methode die kan worden gebruikt in zowel veld- als laboratoriumomgevingen om P. capsici zoosporen in irrigatiewater te detecteren. Het protocol omvat de ontwikkeling van een nieuwe lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) primer set in staat om specifiek versterken P. capsici, gebaseerd op een 1121-base paar (bp) fragment van P. capsici18,19. Een eerder ontwikkelde LAMP primer van Dong et al. (2015) werd gebruikt in vergelijking met de test die werd ontwikkeld voor deze studie20.
De LAMP-test is een relatief nieuwe vorm van moleculaire detectie waarvan is aangetoond dat deze sneller, gevoeliger en specifieker is dan conventionele polymerasekettingreactie (PCR)21. In het algemeen kunnen conventionele PCR-tests niet onder 500 kopieën (1,25 pg/μL) worden gedetecteerd; in tegenstelling, eerdere studies hebben aangetoond dat de gevoeligheid van LAMP kan 10 tot 1.000 keer hoger zijn dan conventionele PCR en kan gemakkelijk detecteren zelfs 1 fg/μL van genomische DNA22,23. Bovendien kan de test snel worden uitgevoerd (vaak in 30 minuten) en on-site (in het veld) met behulp van een draagbaar verwarmingsblok voor versterking en een colorimetrische kleurstof die van kleur verandert voor een positief monster (waardoor de noodzaak van elektroforese wordt verwijderd). In deze studie hebben we de gevoeligheid van PCR- en LAMP-tests vergeleken met behulp van een filterextractiemethode. De voorgestelde detectiemethode stelt onderzoekers en extensiemiddelen in staat om de aanwezigheid van P. capsici sporen uit verschillende waterbronnen in minder dan twee uur gemakkelijk te detecteren. De test is bewezen gevoeliger te zijn dan conventionele PCR en werd ter plaatse gevalideerd door de aanwezigheid van de ziekteverwekker in het irrigatiewater te detecteren dat door een teler wordt gebruikt. Deze detectiemethode zal telers in staat stellen om de aanwezigheid en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker in verschillende waterbronnen te schatten die worden gebruikt voor irrigatie, waardoor verwoestende uitbraken en economische verliezen worden voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het testen van irrigatiewater voor fytopathogenen is een cruciale stap voor telers die irrigatievijvers en gerecycled watergebruiken 27. Irrigatievijvers bieden een reservoir en broedplaats voor een aantal fytopathogenen als overtollig irrigatiewater wordt gericht van het veld naar de vijver die met zich mee alle ziekteverwekkers die aanwezig kunnen zijn geweest16,27. De traditionele methode voor de detectie van een plant pathogenen in een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk kreeg de financiële steun van Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID# FP00016659. De auteurs danken Dr Pingsheng Ji, Universiteit van Georgië en Dr Anne Dorrance, Ohio State University voor het verstrekken van pure culturen van Phytophthora spp. We danken ook Li Wang en Deloris Veney voor hun technische bijstand tijdens het onderzoek.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
