JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Graphengehäuse chemisch fixierter Säugetierzellen für die Flüssigphasenelektronenmikroskopie

Published: September 21, 2020
doi:
10.3791/61458
, ,
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics,Saarland University

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Kennzeichnung von Membranproteinen in Säugetierzellen und zur Beschichtung der Probe mit Graphen für die Flüssigphasen-Scan-Transmissionselektronenmikroskopie vorgestellt. Die Stabilität der Proben gegen die durch Strahlung verursachten Schäden kann auch mit diesem Protokoll untersucht werden.

Abstract

Ein Protokoll wird beschrieben, um den humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2) in der intakten Plasmamembran von Brustkrebszellen mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie (STEM) zu untersuchen. Zellen der Säugetier-Brustkrebs-Zelllinie SKBR3 wurden auf Silizium-Mikrochips mit Siliziumnitrid (SiN)-Fenstern angebaut. Die Zellen wurden chemisch fixiert und HER2-Proteine mit Quantenpunkt-Nanopartikeln (QDs) mit einem zweistufigen Biotin-Streptavidin-Bindungsprotokoll gekennzeichnet. Die Zellen wurden mit mehrschichtigem Graphen beschichtet, um einen hydratisierten Zustand zu erhalten und sie während des MINT-Baus vor Elektronenstrahlschäden zu schützen. Um die Stabilität der Proben unter Elektronenstrahlbestrahlung zu untersuchen, wurde ein Dosisserienexperiment durchgeführt. Graphenbeschichtete und unbeschichtete Proben wurden verglichen. Strahlinduzierte Schäden in Form von hellen Artefakten erschienen für einige nicht beschichtete Proben mit erhöhter Elektronendosis D, während keine Artefakte auf beschichteten Proben erschienen.

Introduction

Die Analyse der Membranproteinfunktion ist für die zellbiologische Forschung und für die Arzneimittelentwicklung unerlässlich. Eine Klasse wichtiger Experimente beinhaltet die Untersuchung von Membranproteinpositionen in Zellen. Diese Informationen können verwendet werden, um Rückschlüsse auf die Zusammenstellung von Proteinen in Proteinkomplexen und deren spezifische Positionen in der Plasmamembran abzuleiten, die durch dynamische Montage und Demontage eine Vielzahl von zellulären Funktionen antreibt. Unter anderem werden Lichtmikroskopie (LM) und Elektronenmikroskopie (EM) zur Untersuchung von Proteinfunktionen in Zellen eingesetzt. LM ermöglicht die Analyse ganzer Zellen in Flüssigkeit; Die Auflösung ist jedoch auf 200-300 nm für konventionelle und bis zu 20 nm für die Superauflösung fluoreszenzmikroskopie unter praktischen Bedingungen1,2beschränkt. EM bietet ca. 1 Auflösung3, aber herkömmliche Probenvorbereitung erfordert Dehydrierung, Metallfärbung, um den Bildkontrast zu verbessern, und einbetten in eine Montagesubstanz, wie Harz, für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)4. Um biologische Proben in einer nativeren Umgebung zu erhalten, können Kryo-EM-Techniken verwendet werden5,6. Die Proben werden schnell in amorphes Eis eingefroren und bei Bedarf geschnitten. Eine weitere Option ist das Einfrieren von EM7.

EM-Techniken zur Untersuchung von Membranproteinen in intakten Zellen in ihrem nativen, flüssigen Zustand sind in den letzten zehn Jahren entstanden8,9,10,11. Eine räumliche Auflösung von 2 nm wurde auf Quantenpunkt (QD) markierten Membranproteinen in ganzen Zellen erreicht, die auf einer SiN-Membran angebaut und von einer Schicht Aus Graphen9umschlossen sind.

Hier werden Details eines Protokolls zur Proteinkennzeichnung und Graphenbeschichtung9,12 beschrieben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die räumliche Verteilung von HER2 in der Membran ganzer, fester Zellen zu analysieren und gleichzeitig die Zellen in einem hydratisierten Zustand zu erhalten. Die Beschichtung mit Graphen verhindert das Trocknen der Zellen im Vakuum und reduziert auch Strahlenschäden13. Diese Methode liefert Informationen über markierte Membranproteine innerhalb der intakten Plasmamembran, aber die Methode ist nicht nützlich für die Untersuchung der zellulären Ultrastruktur, wie es normalerweise mit EM geschieht.

Graphen ist das dünnste bekannte Nanomaterial und besteht aus einem einzigen Kohlenstoffatom dicken kristallinen Blatt in einem Wabengitterangeordnet 14. Es hat einzigartige Eigenschaften, einschließlich hoher Flexibilität und mechanischer Festigkeit. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass defektfreies Graphen für Gase und Flüssigkeiten undurchlässig ist, aber Defekte erlauben Wasserstoffpermeation15. Diese Leckage kann durch die Verwendung von mehrschichtigem Graphen, wie hier verwendet, reduziert werden. Bilayer-Graphen hat sich vor kurzem als nützliche Unterstützung für Kryo-EM-Proben erwiesen, die die Homogenität der dünnen Eisschicht im Vergleich zu Graphenoxid verbessern, wo nur ungleichmäßige Schichten gebildet werden können16. Graphen wurde auch gezeigt, um Strahlschäden von biologischen Proben während der Flüssigphasen-Transmissionselektronenmikroskopie13,17zu reduzieren. Als beispielhaftes Experiment wurde HER2, ausgedrückt in der Säugetier-Brustkrebszelllinie SKBR3, mit QDs18 gekennzeichnet und seine räumliche Verteilung mit MINT aufgezeichnet. Die Zellen wurden auf einem Si-Mikrochip mit einer elektronentransparenten SiN-Membran19ausgesät. Die Mikrochips wurden als Stütze gewählt, da sie robust, kompatibel mit LM und EM sind und das gesamte Etikettierungsverfahren direkt auf dem Mikrochip19durchgeführt werden kann. Nach der Zellanhaftung wurde HER2 mit einem zweistufigen Beschriftungsprotokoll20beschriftet. Zunächst wurde an HER2 eine biotinylierte Anti-HER2-Antikörper-Mimetikverbindung21 befestigt. Die Zellen wurden dann chemisch fixiert, um eine etiketteninduzierte Rezeptorclusterbildung zu verhindern und die Stabilität der zellulären Ultrastruktur zu erhöhen. Streptavidin-beschichtete QDs wurden anschließend mit dem HER2-Antikörper-Mimetikkomplex verknüpft. Das helle Fluoreszenzsignal und der elektronendichte Kern der QDs ermöglichten korrelative Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie (CLEM)20. CLEM ist besonders nützlich, da zelluläre Regionen, die für die MINT-Analyse von Interesse sind, aus den Übersichtsfluoreszenzmikroskopiebildern ausgewählt werden können, die die Lokalisierung von HER2 auf den Zellen hervorheben. Die Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert, um zelluläre Regionen mit hohem HER2-Gehalt zu identifizieren. Danach wurde ein 3-5-schichtiges dickes Graphenblatt zur Beschichtung9,22auf die Zellen übertragen. Anschließend wurde die Probe in einem EM-Probenhalter montiert. DIE MINT-Daten wurden mit hilfe des ringförmigen Dunkelfelddetektors (ADF) erfasst, der Informationen über die räumliche Verteilung von HER2 auf der Zelloberfläche relativ zur Zelloberflächenposition liefert, aber keine Informationen über die Ultrastruktur der Zelle liefert. Um die Stabilität der Probe unter Elektronenstrahlbestrahlung zu bestimmen, wurden die Proben in zunehmender Dosis (D) in einer Bildreihe untersucht. Der Unterschied zwischen graphenbeschichteten und nicht beschichteten Proben wurde untersucht. Es wurden mehrere Arten von Strahlungsschäden bewertet.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet die HER2-überexzessierende Säugetier-Brustkrebszelllinie SKBR3 als Modellsystem für die Ausrichtung auf HER223. Das Protokoll umfasst die Herstellung einer graphenbeschichteten Probe und einer ähnlichen Probe, jedoch ohne Graphenbeschichtung zum Vergleich. Das Experiment wird in doppelter Ausführung vorbereitet, da das SiN-Fenster einmal ig zubrechen und in den meisten Fällen ein experimentelles Duplikat zu erhalten. Die Gesamtausbeute der Methode ist hoch, was bedeutet, dass Mikrochips mit graphenbedeckten Zellen in der Regel mit einem außergewöhnlichen Fehler erhalten werden, auch wenn nicht das gesamte SiN-Fenster in allen Fällen mit Graphen bedeckt sein kann. Duplikate werden im Protokoll nicht beschrieben.

Das Etikettierungsprotokoll (Schritte 1-5) ist vergleichbar mit dem Protokoll der Kennzeichnung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors in COS7-Fibroblastenzellen, die zuvor24veröffentlicht wurden; In diesem Papier wird auf die Handhabung der Mikrochips und die Verwendung der Brunnenplatten verwiesen. Das folgende Protokoll ist für die Kennzeichnung von HER2, Graphenbeschichtung9und die Untersuchung der Strahlungstoleranz der Probe optimiert.

Protocol

1. Reinigung von Mikrochips und Beschichtung mit Poly-L-Lysin (PLL) und Fibronectin-ähnlichem Protein (FLP) Legen Sie zwei Mikrochips mit einer SiN-Membran (2,0 x 2,6 mm) in 50 ml Aceton. Behandeln Sie die Mikrochips vorsichtig mit der flachen Seite nach oben. Vermeiden Sie das Brechen der Kanten mit einer Flachschnabel-Pinzette. Vermeiden Sie es, die Oberseite der Mikrochips zu berühren, wenn Sie mit einer Pinzette umgehen, um einen Bruch des SiN-Fensters zu verhindern.HINWEIS: Man kann auch Polytetrafluorethylen-beschichtete oder Carbon-Spitzen-Pinzette verwenden, um Schäden an den Mikrochips zu verhindern. Waschen Sie die Chips für 2 min, indem Sie vorsichtig den Becher schütteln, beobachten, wie die Mikrochips nicht umkippen. Die Mikrochips auf 50 ml Ethanol übertragen und 2 min waschen, indem Sie das Becherglas vorsichtig schütteln. Stellen Sie sicher, dass die Übertragung schnell erfolgt, damit das überschüssige Aceton nicht eint. Waschen Sie die Mikrochips mit 50 ml Wasser für 10 min. Tauchen Sie die Mikrochips in ein frisch zubereitetes Becherglas mit 20 ml Ethanol. Legen Sie Mikrochips zum Trocknen auf ein Reinraumgewebe. Plasma reinigen Sie die Mikrochips mit 11,5 sccm O2 und 35 sccm Ar bei 70 mTorr und Radiofrequenz (RF)-Ziel von 50 W für 5 min. Legen Sie die Mikrochips in eine laminare Durchflusshaube für sterile Zellarbeit. Bereiten Sie eine Lösung von 0,01% PLL in Wasser vor. Bereiten Sie eine Lösung von 15 g/ml FLP in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor. Bereiten Sie eine 24 Wellplatte unter der laminaren Durchflusshaube vor und füllen Sie 5 Brunnen einzeln mit 1 ml der Lösungen in der folgenden Reihenfolge: gut 1 – PLL; gut 2 – Wasser; gut 3 – Wasser; gut 4 – FLP; gut 5 – PBS und gut 6 – PBS.HINWEIS: Führen Sie Waschschritte durch, indem Sie einen Mikrochip für ein paar Sekunden mit einer Pinzette in den angegebenen 24- oder 96-Brunnen tauchen. Führen Sie Inkubationsschritte durch, indem Sie die Mikrochips im 24 oder 96-Brunnen in der angegebenen Lösung für die angegebene Zeit und Temperatur inkubieren. Übertragen Sie die Mikrochips innerhalb weniger Sekunden auf einen anderen Brunnen. Inkubieren Sie die Mikrochips in PLL-Lösung für 5 min. Dann waschen Sie die Mikrochips zweimal in Wasser. Inkubieren Sie die Mikrochips in FLP für 5 min. Dann waschen Sie die Mikrochips in PBS zweimal. Übertragen Sie beide Mikrochips in Brunnen (eine für jeden Mikrochip) einer neuen 96-Wellplatte, die mit 50 l serumfreiem Medium für die Zellaussaat vorgefüllt ist. Inkubieren Sie die Mikrochips bei 37 °C und 5%CO2, bis die Zellsuspension vorbereitet ist. 2. Saatzellen auf SiN-Membran-Mikrochips Richten Sie alle Vorräte und Geräte in einer laminaren Durchflusshaube ein, um eine sterile Arbeit zu gewährleisten. Waschen Sie die Brustkrebs-Zelllinie SKBR3 einmal in einem Zellkulturkolben mit Wachstumsmedium. Verwenden Sie Das modifizierte Adlermedium (DMEM) von Dulbecco, das 10% fetales Kalbsserum (FCS) und 1% nicht essentielle Aminosäuren (NEAAs) als Wachstumsmedium enthält. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml der Zellablösung, bis sich die Zellen vom Kolben lösen. Fügen Sie 5 ml Wachstumsmedium zu den abgetrennten Zellen im Kolben hinzu. Diese Suspension auf ein Zentrifugenrohr übertragen. Pipette 20 l der Zellsuspension in ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration zu erhalten. Verwenden Sie die folgende Formel.. Bereiten Sie eine dispergierte Zellsuspension von 2,5 x 105 Zellen/ml vor. Berechnen Sie die benötigte Menge der vorbereiteten Zellsuspension durch:und füllen Sie mit Wachstumsmedium bis zum gewünschten Volumen. Fügen Sie 100 l der Zellsuspension in die beiden Bohrungen einer 96-Well-Platte mit pLL- und FLP-beschichteten Mikrochips mit nach oben gerichteter SiN-Membran und 50 l serumfreiem Medium hinzu, so dass jeder Brunnen 25.000 Zellen enthält. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5%CO2 für 5 min, um zu warten, bis die Zellen an den Mikrochip anhaften.HINWEIS: An dieser Stelle können sich Zellen vom Mikrochip lösen, weil sie noch nicht haften. Überprüfen Sie die Dichte der Zellen auf dem Mikrochip mit einem invertierten Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass Zellen das Fenster mit genügend Platz bedecken, um abzuflachen und zu haften (siehe Abbildung 1A).HINWEIS: Bei Bedarf können an dieser Stelle weitere Zellen hinzugefügt werden. Übertragen Sie die Mikrochips in neue Brunnen mit einem Wachstumsmedium von 200 l und brüten Sie bei 37 °C und 5 %CO2 über Nacht. Übertragen Sie am Nachmittag des nächsten Tages beide Mikrochips auf ein serumfreies Medium (Serum-Hungermedium), wenn die Zellen abgeflacht sind und an einer visuell geprüften Koninfluenza (d. h. dem Bruchteil der mit Zellen bedeckten Fensterfläche) von etwa 2/3 (siehe Abbildung 1B) haften. Wechseln Sie zu serumfreiem Medium, je nach Bedarf, um die Zellen in eine definierte Ausgangsbedingung zu bringen, wie für den Vergleich zwischen verschiedenen Experimenten erforderlich25. Bei 37 °C und 5%CO2 über Nacht inkubieren.HINWEIS: Beachten Sie, dass die Zellmengen je nach Wachstumsrate und Zellmorphologie für andere Zelllinien variieren können. 3. HER2-Kennzeichnung und Fixierung Bereiten Sie die Lösungen wie in Ergänzender Tabelle 1beschrieben vor. Arbeiten Sie unter der laminaren Durchflusshaube, um steriles Arbeiten zu gewährleisten. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte, die als Etikettierplatte I bezeichnet wird, und füllen Sie 6 Bohrungen pro Mikrochip mit 200 l der Etikettierplatten-I-Lösungen: PBS/BSA, PBS/BSA/GS, Antikörpermimetic, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA. Verwenden Sie eine Zeile (ein Buchstabe pro Zeile, z. B. A1 bis A6) der Wellplatte pro Mikrochip. Die Etikettierplatte auf 37 °C erwärmen. Bereiten Sie unter einer Rauchhaube eine 24-Well-Platte vor, die als Fixationsplatte bezeichnet wird, und füllen Sie 8 Bohrungen pro Mikrochip mit 500 l der Fixationsplattenlösungen: CB, FA, CB, PBS, PBS, PBS, PBS/Glycine, PBS/BSA.VORSICHT: CB ist durch Einatmen oder orale Einnahme akut giftig und für Gewässer gefährlich. Arbeiten Sie unter der Dunstabzugshaube mit entsprechendem Schutz und entsorgen Sie CB gemäß dem Sicherheitsdatenblatt (SDS). FA ist ätzend und schädlich für Haut und Gesundheit. Arbeiten Sie unter der Dunstabzugshaube und beziehen Sie sich auf die SDS für Informationen über Handhabung und Entsorgung. Bereiten Sie eine 96 Well-Platte, die als Etikettierplatte II bezeichnet wird, vor und füllen Sie 4 Bohrungen pro Mikrochip mit 200 l der Etikettierplatten II-Lösungen: QDs, PBS/BSA, PBS/BSA, PBS/BSA.HINWEIS: Hier wird eine 24-Well-Platte verwendet, um die Mikrochips in den Brunnen besser zu sehen. Um weniger Antikörper-Mimetik (Schritt 3.2) und QDs (Schritt 3.4) zu verwenden, verwenden Sie 96 Well-Platten für diese Schritte. Kenn2 in den Zellen beschriften. Sobald diese Platten fertig sind, beginnen Sie mit der Etikettierung, indem Sie die Mikrochips in die Brunnen der ersten Reihe der Etikettierplatte 1 legen. Waschen Sie die Mikrochips mit PBS/BSA in der 96 WellPlatte, die als Etikettierplatte I gekennzeichnet ist. Blockieren Sie unspezifische Stellen, um eine unspezifische Bindung des Anti-Antikörper-Mimetikzufalls zu verhindern, indem Sie mit PBS/BSA/GS für 5 min bei 37 °C und 5%CO2inkubieren. Inkubieren mit 200 nM Antikörper mimetisch für 10 min bei 37 °C und 5%CO2. Waschen Sie Mikrochip dreimal in PBS/BSA. Fixieren Sie die Zellen. Übertragen Sie die Mikrochips auf die 24 Well-Fixationsplatte in der Dunstabzugshaube.HINWEIS: Von hier aus ist keine sterile Arbeit erforderlich. Einmal mit CB für ein paar Sekunden waschen. Fix Zellen mit 3% FA für 10 min. Einmal mit CB und dreimal mit PBS waschen. Blockieren Sie freie Aldehydgruppen von FA durch Inkubation mit PBS-Glycin für 2 min. Waschen Sie Mikrochips einmal mit PBS-BSA. Befestigen Sie die QDs. Bewegen Sie die Mikrochips auf die 96 Well-Etikettierplatte II. Inkubieren Sie mit 20 nM QDs für 12 min. Waschen Sie die Mikrochips zweimal mit PBS/BSA. Bewahren Sie die Mikrochips in einem Brunnen auf, der PBS/BSA enthält. 4. Lichtmikroskopie der festen Zellen Bereiten Sie eine Glasbodenschale mit einem Durchmesser von 3,5 cm mit 2 ml PBS/BSA-Lösung vor. Nehmen Sie die ersten Mikrochips, legen Sie sie auf den Kopf (Zellen nach unten) in die Glasbodenschale und legen Sie die Schale in das Fluoreszenzmikroskop. Senken Sie den Mikrochip langsam in die Flüssigkeit, um Schäden an den Zellen zu verhindern. Erfassen Sie Differentialinterferenzkontraste (DIC) und Fluoreszenzbilder jedes Mikrochips mit einem 40-fachen Objektiv und dem entsprechenden Fluoreszenzkanal.HINWEIS: Hier wird eine Anregungswellenlänge von 540-580 nm und eine emittierende Wellenlänge von 607-683 nm verwendet, um QD655 zu erkennen. Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Mikrochip. 5. Post-Fixierung Führen Sie alle Schritte unter der Dunstabzugshaube aus. Füllen Sie 6 Bohrungen pro Mikrochip einer 96-Well-Platte mit 200 l der Post-Fixierungslösungen:CB, GA, CB, PBS, PBS, PBS.VORSICHT: GA ist gefährlich für Gewässer, schädlich für Haut, Atemwege und Augen. Arbeiten Sie unter der Dunstabzugshaube und beziehen Sie sich auf die SDS für Informationen über Handhabung und Entsorgung. Legen Sie beide Mikrochips in ihre jeweiligen Brunnen mit den Zellen nach oben. Einmal mit CB waschen. Fix Zellen mit 2% GA für 10 min. Einmal mit CB waschen. Dreimal mit PBS/BSA waschen.HINWEIS: Der erste Fixierungsschritt mit FA fixiert bereits die biologische Struktur, aber es kann immer noch zu einer reduzierten Membranproteindiffusion kommen, die möglicherweise zu einer etiketteninduzierten Clusterbildung aufgrund des Vorhandenseins mehrerer Streptavidine pro QD führt. Halten Sie die Zeit der experimentellen Schritte von der FA-Fixierung bis zum GA so kurz wie möglich, um die Diffusion der Proteine in der Membran zu minimieren. In PBS/BSA speichern, um osmotische Schocks und 0,02 % Natriumazid (NaN3) zu verhindern, um das Bakterienwachstum bei 4 °C bis zur Graphenbeschichtung in einer neuen Bohrplatte zu verhindern. Gutplatte mit Paraffinfolie versiegeln, um ein Trocknen zu verhindern. Die Mikrochips und Zellen sind bei 4 °C bis zu 2 Wochen stabil.VORSICHT: NaN3 ist wassergefährdend und durch orale Einnahme akut giftig, für die Haut und die Atemwege. Arbeiten Sie unter der Dunstabzugshaube und beziehen Sie sich auf die SDS für Informationen über Handhabung und Entsorgung. 6. Reinigung und Übertragung von Graphen auf Salzkristalle Entfernen Sie Poly(Methylmethacrylat) (PMMA)-Graphen aus PMMA-Graphen-auf-Polymer (Abbildung 2A). Pipetten Sie ein paar Tröpfchen Wasser auf dem Polymer um das PMMA-Graphen.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das PMMA-Graphen leicht aus dem unterstützenden Polymer kommt, während es auf der Wasseroberfläche schwimmt. Tauchen Sie das PMMA-Graphen-auf-Polymer mit einem Winkel von 30-45° in Wasser ein, um das PMMA-Graphen freizusetzen.HINWEIS: Das Polymer sollte nur leicht benetzt werden. Das Pipettieren von zu viel Wasser auf das Polymer hebt das PMMA-Graphen an und faltet es möglicherweise. Ätzen Sie kupferbasierte Verunreinigungen mit einer Natriumpersulfatlösung (Abbildung 2B).HINWEIS: Kommerzielles Graphen, das auf Kupferfolie angebaut wird, enthält oft Submikrometer-Kupferrückstände, die mit einer Kupfer-Etchant-Lösung entfernt werden können22. Bereiten Sie eine 50 ml Lösung von 0,42 M Natriumpersulfat in Wasser vor. PMMA-Graphen mit einem Standardglasschlitten in die Natriumpersulfatlösung mit der Graphenseite nach unten übertragen. PMMA-Graphen wird auf der Lösung schweben. Lassen Sie das PMMA-Graphen über Nacht in der Natriumpersulfatlösung. Entfernen Sie das PMMA-Graphen aus der Natriumpersulfatlösung und legen Sie es mit einem Glasschlitten auf sauberes Wasser. Lassen Sie es eine halbe Stunde auf dem Wasser schweben. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt insgesamt dreimal, um alle Natriumpersulfatrückstände aus dem PMMA-Graphen zu entfernen. Übertragen Sie das PMMA-Graphen auf einen Natriumchlorid -Kristall (NaCl). Bereiten Sie eine gesättigte Lösung von NaCl in Wasser in einer Petrischale vor. Übertragen Sie das PMMA-Graphen über die NaCl-Lösung mit der Graphenseite nach unten mit einem Glasschlitten. Halten Sie einen NaCl-Kristall mit Pinzette und nehmen Sie das schwimmende PMMA-Graphen auf.HINWEIS: Die Größe des NaCl-Kristalls sollte etwas größer sein als die Größe des PMMA-Graphens, um zu vermeiden, dass das hervorstehende Graphen am Rand des Salzes gefaltet oder das Graphen mit einer Pinzette in Berührung kommt. In diesen Experimenten wird NaCl-Kristall von 12 mm x 12 mm x 0,5 mm verwendet, um ein 10 mm x 10 mm Graphenblech aufzunehmen und anschließend zu stützen. Halten Sie das PMMA-Graphen-auf-Salz 2 min vertikal, um überschüssiges Wasser abfließen zu lassen. Lassen Sie das PMMA-Graphen-auf-Salz bei Raumtemperatur 30 min trocknen und im Ofen bei 100 °C 20 min backen, um Wasser vollständig zu entfernen. Entfernen Sie PMMA mit einer Acetonwäsche (Abbildung 2C). Aceton in einer Glas-Petrischale auf einer Kochplatte in der Dunstabzugshaube auf 50 °C vorheizen. Achten Sie sorgfältig auf die Temperatur, um Feuer zu vermeiden. Das PMMA-Graphen-auf-Salz in die mit Aceton gefüllte Petrischale eintauchen und 30 min lang das PMMA auflösen lassen. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt insgesamt dreimal mit neuem, sauberem Aceton. Lassen Sie das Graphen-auf-Salz-Luft-Luft gründlich trocknen, bevor Sie es für die Probenvorbereitung verwenden. 7. Graphenbeschichtung HINWEIS: Das Graphenbeschichtungsverfahren ist schematisch in Abbildung 3Adargestellt. Waschen Sie einen Mikrochip, der mit festen Zellen hergestellt und HER2 mit reinem Wasser versehen ist, um Salzrückstände aus dem Puffer zu entfernen. Legen Sie den Mikrochip auf ein Filterpapier. Die Zellen sind als dunkle Flecken sichtbar (Abbildung 3B). Schneiden Sie das mehrschichtige Graphen auf NaCl-Kristall in ein Stück, das mit einer Rasierklinge in das SiN-Fenster eines Mikrochips passt. Bereiten Sie ein Becher aus reinem Wasser vor und entfernen Sie das Graphen aus dem NaCl-Kristall, indem Sie den Kristall in Bezug auf die Wasseroberfläche um etwa 45° geneigt und das Wasser berühren. Das Graphen schwimmt auf der Wasseroberfläche (Abbildung 3C). Fangen Sie das Graphen mit einer Metallschleife von der Oberfläche des Wassers. Das Graphen schwebt innerhalb des Tröpfchens unterhalb der Schleife (Abbildung 3D). Berühren Sie die obere Oberfläche des Mikrochips mit der unteren Schleifenoberfläche. Der Mikrochip klebt an der Metallschleife. Das Graphen ist auf dem Mikrochip zu sehen (Abbildung 3E). Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop Filterpapier, um das restliche Wasser aus dem Mikrochip zu entfernen, sodass das Graphen alle Zellen im SiN-Fenster abdeckt.HINWEIS: Das Graphen bewegt sich, wenn es gefleckt wird. Stellen Sie sicher, dass das Graphen oben im Fenster bleibt, indem Sie den Mikrochip nur mit dem Rand des Filterpapiers berühren. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Mikrochip aus der Metallschleife zu entfernen und auf ein Filterpapier zu legen. Das Graphen ist als violetter Schimmer auf dem Mikrochip sichtbar (Abbildung 3F). Übertragen Sie den Mikrochip vom Papier in ein Fach Petrischale. Pipette ein Tröpfchen Wasser in einem der freien Fächer und schließen Sie den Deckel, um eine wassergesättigte Atmosphäre zu bieten. Versiegeln Sie die Fachschale mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bei Bedarf bei weiteren Messungen bei 4 °C im Kühlschrank auf. 8. STEM Stellen Sie den STEM bei 200 kV Strahlenergie mit einer Ausrichtungs-/Testprobe für eine Sondengröße von mindestens 0,2 nm ein, indem Sie die Kondensatorlinsen, einen Sondenstrom I = 180 pA (Informationen über den Sondenstrom für verschiedene Mikroskopeinstellungen wird vom Hersteller mit einer Genauigkeit von 5 % bereitgestellt) und einen Strahlkonvergenzhalbwinkel von 13,2 mrad durch Einsetzen einer Blende einstellen. Stellen Sie den ADF-MINT-Detektor,der den Halbwinkelbereich (innen und außen) öffnet, auf 68-280 mrad, indem Sie die Einstellungen der Projektorlinse anpassen. Legen Sie die MINT-Bildgröße auf 2048 x 2048 Pixel fest, und die Pixelverweilzeit t = 6 s. Laden Sie den Mikrochip mit graphenbeschichteten Zellen in einen Standard-Probenhalter für TEM so, dass die Zellen nach oben gerichtet sind. Laden Sie den Halter in das Elektronenmikroskop. Mit den Einstellungen in Schritt 8.1 erhalten Sie ein Übersichtsbild bei der Vergrößerung (M) = 800x (Abbildung 4). Identifizieren Sie einen Bereich, der für eine Zelle von Interesse ist. Stellen Sie die QDs mit einem ADF-Detektor bei M = 80.000x bei einer Pixelgröße d = 1,3 nm (Abbildung 4) mit den Einstellungen in Schritt 8.1 ab. Erfassen Sie ein Bild des Bereichs nach belichtung mit einer niedrigeren Vergrößerung (hier M = 50.000x), um die exponierte Fläche anzuzeigen (Abbildung 4). Berechnen Sie die Elektronendosiswobei e die elementare Ladung ist. Mit den oben angegebenen Einstellungenund ein Fehler von 5%. Erfassen Sie 20 Bilder für eine Dosisserie mit den gleichen Einstellungen, jedoch mit t = 60 s, was zu einer. Um das Vorhandensein von Graphen zu bestätigen, schalten Sie das Mikroskop auf TEM bei M = 1.200x, wählen Sie einen Bereich in der Nähe einer Zelle aus, und wechseln Sie in den Beugungsmodus. Zeichnen Sie ein Beugungsmuster bei einer Belichtungszeit von 0,5 s, 2048 x 2048 x 3 Pixeln und einer ausgewählten Flächenöffnung von 50 m auf (Abbildung 4). Am Ende der Sitzung die Probe aus dem Mikroskop entfernen, den Mikrochip wieder in die Fachschale legen, die Schale mit Paraffinfolie versiegeln und bei Bedarf bei weiteren Messungen bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren. Wählen Sie den zweiten Mikrochip, der auf die gleiche Weise wie der erste Mikrochip, aber ohne Graphenbeschichtung hergestellt wird. Wiederholen Sie die Schritte 8.2-8.11, aber jetzt für dieses Beispiel. Zeichnen Sie ein Beugungsmuster mit den gleichen Einstellungen wie in den obigen Einstellungen auf, als Vergleich (Abbildung 4). 9. Analyse HINWEIS: Für die automatisierte Erkennung von QD-Positionen in einem MINT-Bild verwendet die Analyse ein Plugin mit lokalem Design für ImageJ (NIH), wie an anderer Stelle beschrieben20. Das Plugin ist auf Anfrage erhältlich. Die Software wendet automatisch die folgenden Schritte an, um Partikel in einem MINT-Bild zu erkennen: Wenden Sie einen Gaußschen Filter an, um Pixelrauschen zu reduzieren. Wenden Sie einen Fast Fourier Transform (FFT) Bandpassfilter an, um nur Nanopartikel zu erhalten. Legen Sie einen Schwellenwert fest, um das Bild zu binarisieren. Verwenden Sie einen Partikeldurchmesser von 10 nm mit einem Toleranzfaktor von 2 für die Partikeldetektion. Erkennen Sie Partikelpositionen. Messen Sie den Abstand zwischen Zehn QD-Paaren pro Reihe. Hier wurden pro Serie 10 Distanzen unterschiedlicher Größe gemessen. Berechnen Sie die relative Veränderung der Partikelentfernung, indem Sie jede Partikelentfernung mit der Entfernung im ersten Bild vergleichen, indem Sie:.

Representative Results

Abbildung 1A zeigt Zellen, die so ausgesät sind, dass das Fenster bedeckt ist, aber mit genügend Platz, um sie abzuflachen und zu haften, was zu einer Konfluenz von etwa 2/3rd führt (Abbildung 1B). Falls zu viele Zellen auf einem Mikrochip gesät werden (Abbildung 1C), gibt es nicht genügend Platz für alle Zellen, um am Mikrochip haften zu können. Abbildung 1D zeigt den gleichen Mikrochip nach 24 h. Mehr als die Hälfte der Zellen hat sich nicht abgeflacht. Wenn dagegen zu wenige Zellen gesät sind (Abbildung 1E), erhält das SiN-Fenster nach 24 h einen großen leeren Raum, wie in Abbildung 1Fzu sehen ist. Abbildung 1G zeigt das DIC-Bild der Zellen in Abbildung 1A und Abbildung 1B. Abbildung 1H zeigt das entsprechende Fluoreszenzbild falsch gelb gefärbt, was auf eine erfolgreiche Kennzeichnung von HER2 hinweist. Repräsentative MINT-Daten sind in Abbildung 4dargestellt. Untersucht wurden graphenbeschichtete (linke Spalte) und nicht beschichtete (rechte Spalte) SKBR3-Zellen. Abbildung 4A,B zeigen M = 800x Übersichtsbilder der Zellen im Fenster. Die als Eingaben dargestellten Bereiche wurden während der Dosisreihe mit M = 80.000x abgebildet, siehe Abbildung 4C,D. Die QDs sind hier als helle Flecken sichtbar. Abbildung 4E und Abbildung 4F zeigen M = 50.000x vergrößerte Bilder, die an den Stellen der Rechtecke in Abbildung 4C, D aufgenommenwurden. Beide Bilder wurden nach dem Erwerb einer Dosisreihe mit D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. Die Dosisreihe wurde bei M = 80.000x aufgezeichnet. Die freiliegenden Bereiche können als Rechtecke erkannt werden, wobei das Rechteck für die nicht beschichtete Probe deutlich sichtbar war (Abbildung 4F). Um das Vorhandensein von Graphen zu überprüfen, wurden Beugungsmuster von Bereichen ohne Zellen, aber mit oder ohne Graphen im SiN-Fenster erfasst. Die sechseckige Struktur des Graphens wurde im Beugungsmuster der graphenbeschichteten Probe beobachtet (Abbildung 4G), während es für die nicht beschichtete Probe fehlte (Abbildung 4H). Das Beugungsmuster von Einkristallgraphen hat aufgrund der hochgeordneten sechseckigen Struktur von Graphen eine sechsfache Symmetrie. Die sechseckige Struktur zeigt also das Vorhandensein von Graphen auf den Proben an. Um die Wirkung der Elektronenstrahlbeleuchtung auf die Probe zu untersuchen, wurden in einer Bildserie mit einer akkumulierenden Elektronendosis STEM-Bilder aufgenommen. Repräsentative Ergebnisse für nicht beschichtete und graphenbeschichtete Proben sind in Abbildung 5A-D bzw. Abbildung 5E-Gdargestellt. Alle Daten wurden am Rand der Zelle erfasst, wo die Zelle die flachste ist und die beobachtete Struktur somit der SiN-Membran am nächsten ist. Die Exposition einer nicht beschichteten Probe führte dazu, dass helle Strukturen auf den Zelloberflächen bei D = (1,9 x 0,1) x 103 e-/a2 (Abbildung 5B) auftraten. Diese Strukturen wurden mit höheren Dosen größer, so dass sie im letzten Bild der Serie bei D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/a2 (Abbildung 5C,D) deutlich sichtbar waren. Diese Flecken tauchten auf keiner der graphenbeschichteten Proben auf (Abbildung 5E-G). Weitere Mikrochips wurden mit dem oben beschriebenen Protokoll hergestellt und untersucht. Insgesamt wurden sechs beschichtete und sieben nicht beschichtete Proben untersucht. Zwei von sieben nicht beschichteten Proben zeigten diese Artefakte. Keine der beschichteten Proben zeigte zusätzliche helle Flecken. Als weiteres Maß für die Strahlungsschäden wurde der Abstand zwischen QDs untersucht. Sollten strukturelle Schäden auftreten, würde man erwarten, dass sich die Entfernungen zwischen den QDs ändern. Änderungen der Entfernungen wurden für verschiedene QD-Paare mit akkumulierendem D für einen Bereich von Paarabständen gemessen. Abbildung 5H zeigt, dass die relative Veränderung der Partikel für nicht beschichtete Proben im Durchschnitt unter 1,3 % blieb, während der durchschnittliche relative Abstand bei den beschichteten Proben unter 0,8 % blieb. Man kann daher schlussfolgern, dass die Graphenbeschichtung die Probe stabilisiert hat, aber auch die eingetrockneten Proben ohne Graphenbeschichtung bemerkenswert stabil waren. Abbildung 1: Zellsaat auf einem SiN-Fenster eines Silizium-Mikrochips und HER2 beschriftet. (A) Beispielhaftes Bild eines SiN-Fensterbereichs mit SKBR3-Zellen 5 min nach dem Aussaat auf dem Mikrochip. (B) Dieselben Zellen breiten sich nach 24 h. (C) SKBR3-Zellen auf einem Si-Mikrochip 5 min nach der Aussaat auf demselben SiN-Fenster aus. (D) Gleiche Zellen wie in (C) nach 24 h. Die Zellen haben sich nicht richtig abgeflacht, da es zu viele Zellen auf den Chips bei der Aussaat gab. (E) Zellen auf einem Mikrochip 5 min nach der Aussaat. (F) Nur wenige Zellen waren auf dem Fenster sichtbar, weil zu wenige Zellen auf dem Mikrochip gesät wurden. (G) DIC-Bild der gleichen SKBR3-Zellen nach QD-Beschriftung von HER2. (H) Overlay-Bild von DIC und entsprechendefluoreszenzbild von markierten SKBR3-Zellen mit HER2-QD655 (falsch gelb gefärbt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Reinigung und Übertragung von Graphen auf NaCl-Kristallen. (A) PMMA-Graphen-auf-Polymer wird in reines Wasser getaucht, um PMMA-Graphen freizusetzen. PMMA-Graphen kann mit einer Glasrutsche gefangen werden. (B) Kupferbasierte Kontaminationen wurden mit Natriumpersulfatlösung geätzt. Um das Graphen zu reinigen, wurde es in einen Becher mit entionisiertem Wasser übertragen. Diese Schritte wurden dreimal wiederholt. Das PMMA-Graphen wurde dann in gesättigte NaCl-Lösung in reinem Wasser übertragen. Ein NaCl-Kristall wurde verwendet, um das Graphen aus der Salzlösung zu holen. (C) Das PMMA-Graphen auf NaCl-Kristall wurde 30 min bei Raumtemperatur ausgetrocknet. PMMA wurde entfernt, indem der Block 30 min in Aceton inkubiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Graphenbeschichtung von Zellen, die auf einem Si-Mikrochip gesät sind. (A) Verfahren der Graphenbeschichtung. Graphen auf NaCl-Kristall wird auf die Wasseroberfläche freigesetzt. Das Graphenstück wird dann mit einer Metallschleife gefangen und auf den Si-Mikrochip übertragen. (B) Mikrochip (2,0 x 2,6 mm) mit einem SiN-Fenster mit den Abmessungen 400 x 160 m ohne Graphen. SKBR3-Zellen waren als dunkle Flecken sichtbar. (C) Graphen (roter Kreis), der auf der Oberfläche eines mit Wasser gefüllten Bechers schwebt. (D) Graphen mit einer Metallschlaufe gefangen. (E) Der Mikrochip, der am Wassertröpfchen befestigt ist, so dass sich das Graphen auf dem SiN-Fenster befand. (F) Mikrochip nach Graphenbeschichtung. Das Graphen war als violetter Schimmer sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: MINT von graphenbeschichteten und unbeschichteten SKBR3-Zellen am SiN-Fenster. (A) MINT-Bild einer graphenbeschichteten Probe, die bei einem M = 800x. (B) MINT-Bild einer nicht beschichteten Probe aufgenommen wurde, die bei M = 800x aufgenommen wurde. (C) M = 80.000x Bild, das an der Position des blauen Rechtecks in A aufgenommen wurde. Gelbe Linien stellen Beispiele für Entfernungen dar, die innerhalb des Partikels gemessen wurden. (D) M = 80.000x Bild, das an der Position des blauen Rechtecks in B aufgezeichnet wurde. Gelbe Linie stellt Beispiele entfernungen innerhalb von Partikeln gemessen. (E) M = 50.000x Bild der gleichen Region wie C, das D ausgesetzt ist = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. (F) M = 50.000x Bild der gleichen Region wie D und d = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. Die exponierte Fläche war deutlich zu sehen. (G) Beugungsmuster einer graphenbeschichteten Probe aus einem Bereich ohne Zellen. Die sechsfache Symmetrie des Graphens ist als helle Flecken sichtbar. (H) Beugungsmuster einer Probe ohne Graphen ohne 6-fachhelle Flecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Artefakte, die auf Proben ohne Graphenbeschichtung entstehen. (A) Erste Bilder von Regionen auf Proben ohne Graphenbeschichtung, die bei M = 80.000x aufgenommen und D = (0,39 x 0,02) x 102 e-/2- ausgesetzt sind. (B) Bilder mit den ersten Artefakten, die bei D = (1,94 x 0,1) x 103 e-/2 (gelbe Pfeile) entstehen. (C, D) Letztes Bild der Serie, aufgenommen mit D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. Artefakte waren als helle Flecken sichtbar. (E-G) Graphen beschichtete Proben ohne entstehende Artefakte. (E) D = (0,39 x 0,02) x 102 e-/2 (F) D = (1,94 x 0,1) x 103 e-/2 (G) D = (7,8 x 0,4) x 103 e-/2. (H) Relative Veränderung der Partikelabstände für graphenbeschichtete und nicht beschichtete Proben. Zwei der nicht beschichteten Proben, die Artefakte zeigen, von denen eine in (A-C) und das letzte Bild der zweiten Probe in D gezeigt wurde, sowie drei beschichtete Proben wurden analysiert (eine ist in E-G dargestellt). Insgesamt wurden pro Probe zehn QD-Paare mit Abständen zwischen 250 nm und 3 m untersucht. Die relative Änderung spiegelt den Durchschnitt aller Messungen in einer Gruppe wider. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Ergänzende Tabelle 1: Rezepte für Lösungen und Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Um die Proteinfunktion besser zu verstehen, ist es wichtig, Informationen über Proteinstandorte in der Plasmamembran intakter Zellen zu erhalten. Zu den Methoden zum Abrufen dieser Informationen gehören die Superauflösungsfluoreszenzmikroskopie1,2. Obwohl sich die superhochauflösende Mikroskopie in den letzten Jahren weiterentwickelt hat, ist ihre Auflösung für praktische Bedingungen von Zellexperimenten immer noch auf etwa 20 nm begrenzt, während typische Rezeptorproteine Größen im Bereich von 1-10 nm haben. Die Bildgebung von Proteinen auf Einzelzell- und Einzelmolekülebene mit ausreichender Auflösung zur Visualisierung von Proteinen ist mit EM möglich. Aber aufgrund der Schnitte lassen herkömmliche EM-Methoden die Zelle in der Regel nicht intakt26, was zum Verlust wichtiger Informationen über den Kontext und die räumliche Verteilung von Proteinen in der Plasmamembran führt. Methoden für ganze Zellen mit Kryo-TEM wurden entwickelt6, es ist machbar, Protein-Etikettierung mit Kryo-EM27zu kombinieren, auch Kryo-STEM wurde28nachgewiesen. Kryo-EM-Workflows sind jedoch für die Untersuchung der zellulären Ultrastruktur und Proteinstruktur optimiert, und nicht so sehr für die Analyse der räumlichen Verteilungen von Membranproteinen. Die Trockenpunkttrocknung ist eine weitere Methode der ganzzelligen Präparation, aber die Proben werden mehreren Trocknungsschritten unterzogen, und die Technik ist sehr zeitaufwändig29. Membranproteine wurden auch mittels Gefrierfraktur7untersucht. Bei dieser Methode werden Zellen fixiert, eingefroren und gebrochen. Die gebrochenen Teile werden durch Kohlenstoff- und Platinschichten repliziert und die biologische Probe entfernt. Die Repliken können dann mit EM30analysiert werden. Eine ganze Zellanalyse ist mit Gefrierfraktion nicht möglich, da Informationen über die Verteilung von Proteinen in der Membran im Kontext der gesamten Zelle verloren gehen.

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht es, die Zellmembran zu untersuchen, ohne die Probe9,,31verdünnen zu müssen. Die Zellen bleiben intakt, so dass die Lokalisation der Membranproteine aus den Fluoreszenzbildern sichtbar ist, die mit den EM-Bildern korreliert sind. Die Untersuchung von Proteinen auf Einzelzell- und Einzelmolekülebene innerhalb intakter Zellen im hydratisierten Zustand hat sich mit einer Auflösung von 2 nm mit einer Auflösung von 2 nm mit einer Auflösung von QD-markierten Proteinen mit dieser Graphengehäusemethode9als möglich erwiesen. Die Beibehaltung von Zellen in ihrem nativen Zustand ist von entscheidender Bedeutung, da sie die räumliche Verteilung von Membranproteinen so bewahrt, dass Analysen auf Einzelzell- und Einzelmolekülebene möglich sind, was für das Verständnis von Proteinfunktionen wichtig ist, und neue Medikamente für Therapieansätze zu entwickeln.

Ein weiterer kritischer Aspekt der Abbildung biologischer Proben mit EM ist die Strahlenschädigung der Proben, die durch den Elektronenstrahl verursacht wird. Lösungen umfassen oft die Reduzierung der Elektronendosis so weit wie möglich oder verschiedene Beschichtungsmethoden, wie z. B. das Verkapseln der Probe zwischen dünnen Schichten von Kohlenstoff32. Unsere Methode zeigt, dass die Graphenbeschichtung strahlinduzierte Artefakte reduziert, die auf der Zelloberfläche für unbeschichtete Proben entstehen. Die Untersuchung der chemisch fixierten und graphenbeschichteten biologischen Proben ist unter Elektronenstrahlbestrahlung bei 200 keV Strahlenergie bis D = (7,8 x 0,4) x 103 e–/2 ohne Strahlungsschäden, wie helle Flecken, möglich, die in der Probe auftreten. Im Vergleich zu anderen EM-Methoden, die eine aufwendige Probenvorbereitung beinhalten, z. B. Färbung, Einbettung, (Kryo-)Schnitt, Frakturierung usw., ist die hier beschriebene Methode weniger zeitaufwändig. Die Etikettierung der Proteine erfolgt innerhalb weniger Stunden, und die Graphenbeschichtung erfordert für ausgebildete Forscher nur etwa 15 Minuten. Die Probenvorbereitung ist mit den Verfahren vergleichbar, die für die Fluoreszenzmikroskopie erforderlich sind.

Das Protokoll kann in einigen Schritten geändert werden. Das Graphen auf dem Mikrochip kann auch luftgetrocknet werden, um sicherzustellen, dass sich das Graphen nicht bewegt, wenn es mit einem Filterpapier gefleckt wird. Wenn das Graphen mit Salz verunreinigt ist, ist es möglich, es etwa eine Stunde auf der Wasseroberfläche schweben zu lassen, um das Salz aufzulösen und so die Kontamination zu minimieren. Auftretende Kupfer- oder PMMA-Kontamination enden auf dem Graphen kann durch Erweiterung der entsprechenden Ätzschritte im Protokoll reduziert werden. Andere Graphenbeschichtungsverfahren wurden beschrieben, bei denen beispielsweise Graphen-PMMA direkt auf Zellen abgelagert wurde und das PMMA durch Waschen in Aceton nach33entfernt wurde. Bei unserem Verfahren wurde PMMA vor der Beschichtung entfernt, um mögliche Schäden an den Zellen durch zusätzliche Acetonwaschschritte zu vermeiden. NaCl wurde hier als Substrat gewählt, weil es flach ist, so dass es das Graphen nicht faltet, und es löst sich in Wasser auf, um das Graphen9freizusetzen. Außerdem kann es in die gewünschte Größe geschnitten werden und es werden keine Substratrückstände auf dem Graphen zurückgelassen. Aber unter Berücksichtigung dieser Kriterien können möglicherweise auch andere Substrate wie Kaliumchlorid verwendet werden.

Um die Wahrscheinlichkeit einer möglichen etiketteninduzierten Clusterbildung zu verringern, kann der GA-Fixierungsschritt direkt nach der FA-Fixierung implementiert werden, nach der alle Membranproteine immobilisiert werden. Der erste Fixierungsschritt mit FA fixiert bereits die biologische Struktur, aber ein reduziertes Niveau der Membranproteindiffusion kann immer nochauftreten 34, möglicherweise was zu einer etiketteninduzierten Clusterbildung aufgrund des Vorhandenseins von multiplem Streptavidin pro QD führt. Die Fixierung mit GA kann zu einem Autofluoreszenzsignal während LM führen und erfolgt daher nach LM im beschriebenen Protokoll, kann aber wie an anderer Stelle beschrieben reduziert werden34. Cacodylate Puffer ist ziemlich giftig, und andere Fixative können auch verwendet werden, aber Cacodylat wird hier verwendet, da es ein häufig verwendeter Puffer für EM-Protokolle ist, vermeidet Ausscheidungen, verhindert das Wachstum von Bakterien und Pilzen, und ist kompatibel mit Calciumionen, die benötigt werden, um die ultrastrukturelle Integrität der Lipidmembranen zu erhalten35. Bei Bedarf kann Osmiumtetroxid als zusätzliche Fixierung zur Stabilisierung der Lipide verwendet werden. Dies würde dazu beitragen, den Kontrast der Zellstruktur zu verbessern, aber auch ein weiteres Metall in das System einzubauen und den Kontrast auf den QDs zu reduzieren.

Das hier beschriebene Protokoll enthält viele Schritte, die eine gute Anweisung erfordern. Vor dem Umgang mit Mikrochips ist ein gewisses Training erforderlich, um zu vermeiden, dass die SiN-Oberfläche der Mikrochips zerkratzt wird und um Bruch zu vermeiden. Wie bereits erwähnt, wird empfohlen, Mikrochips in Duplikaten vorzubereiten, da das SiN-Fenster von Zeit zu Zeit brechen kann. Die erforderliche Anzahl von Zellen auf einem Mikrochip zu erhalten erfordert auch einige Erfahrung. Die Beschichtung der Zellen mit Graphen erfordert einiges Training, da es schwierig sein kann, den richtigen Neigungswinkel zu finden, um Graphen auf Demwasser zu schweben. Wenn man das Graphen aus dem Wasser fängt, kann es auch schwierig sein, das dünne Graphen zu sehen. Sobald sich das Graphen auf dem Mikrochip befindet, muss überschüssiges Wasser mit einem Filterpapier abgefleckt werden. Dies sollte nur mit der Spitze eines Filterpapiers erfolgen, um zu vermeiden, dass das Graphen aus dem Mikrochip entfernt wird.

Die Graphenbeschichtung verhinderte, dass Artefakte auf der Probe auftauchten. Aber auch für D < 4 x 102 e–/2 tauchten keine Artefakte für die nicht beschichtete Probe auf, und Artefakte erschienen nur für 2 unbeschichtete Proben. Daher scheinen auch Untersuchungen von nicht beschichteten Zellen möglich, obwohl es besser wäre, Graphen zu verwenden und das Risiko der Artefaktbildung zu vermeiden. Die Zusammensetzung dieser Artefakte kann in der Zukunft analysiert werden, um Hinweise darauf zu geben, wie ihre Bildung zu verhindern ist. Hinsichtlich der strukturellen Stabilität der Zellen wurde nur eine geringfügige Verbesserung der Graphenbeschichtung beobachtet. Die festen Zellen wurden offenbar in den untersuchten dünnen Bereichen stabilisiert, wo sich ihre Struktur in unmittelbarer Nähe der SiN-Membran befand. Was wir hier jedoch nicht untersucht haben, waren Trocknungsartefakte, von denen bekannt ist, dass sie für Zellproben auftreten, wenn sie Vakuum ausgesetzt sind4. Die Trocknung der Zellen würde zu einer Schrumpfung der Zellen führen, so dass sich dadurch auch die QD-Abstände ändern würden. Bei der hier verwendeten Elektronendosis blieb der Abstand der QDs graphenbeschichteter und unbeschichteter Proben stabil. Weitere Studien sind erforderlich, um die Wirkung der Graphenbeschichtung auf die Zellen für EM zu untersuchen.

Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die chemische Fixierung der Zellen notwendig ist; Daher können keine Live-Zell-Experimente durchgeführt werden. Sollte die Kennzeichnung jedoch nicht benötigt und Zellen mit höherer Strukturstabilität verwendet werden, z.B. Bakterien, können unfixierte Zellen für EM36 in Graphen eingeschlossen werden, wenn auch mit einer anderen Elektronendosistoleranz. Außerdem sind die Proteine nicht direkt nachweisbar, so dass QDs benötigt werden, um die Proteine zu visualisieren. Die Methode würde von kleineren Etiketten profitieren. Ein Diskussionspunkt ist, ob es gut oder schlecht ist, dass die Ultrastruktur nicht deutlich sichtbar ist. Unsere Methode ähnelt der der Fluoreszenzmikroskopie, bei der nur ausgewählte Proteine sichtbar sind37. Eine Erhöhung der Sichtbarkeit der Ultrastruktur würde dem Bild auch viel mehr Informationen hinzufügen und dann irgendwann die Erkennung der einzelnen Beschriftungspositionen verhindern. Darüber hinaus ist die hier beschriebene Methode für eine Proteinart, und Ergänzungen des Protokolls sind erforderlich, um mehrere Proteine kennzeichnen zu können. Schließlich funktioniert die Methode, wenn ein kleines hochwertiges, spezifisch bindendes Molekül wie Antikörper-Mimetik21 oder Nanokörper38 zur Verfügung steht. Häufig verwendete Antikörper sind viel größer und würden den Nachweis des Funktionszustandes der Proteinuntereinheiten in Oligomere verhindern.

Unsere Methode ist nützlich für die Untersuchung der Proteinfunktion an ganzen Zellen mit EM, während die Zellen in hydratisiertem Zustand gehalten werden. Es ist leicht möglich, eine Reihe von Zellen zu untersuchen. Andere Arten von Zellen und Proteinen können ebenfalls untersucht werden. Wenn keine Proteinkennzeichnung erforderlich ist, kann eine Teilmenge des Protokolls für die Graphenbeschichtung einer Vielzahl biologischer Proben verwendet werden. Die Fähigkeit, ganze Zellen zu untersuchen, ist in der zellulären Forschung relevant, um Korrelationen der Membranproteinfunktion auf molekularer Ebene zu verstehen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken D. B. Peckys für die Hilfe beim Zellkulturprotokoll, F. Weinberg für die Durchsicht des Manuskripts, T. Trampert für Hilfe bei den Experimenten und den Figuren, S. Smolka für die Hilfe bei den Figuren und E. Arzt für seine Unterstützung durch INM. Diese Forschung wird von der Else Kröner-Fresenius-Stiftung gefördert.

Materials

Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 – 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 – 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 – 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400×150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 – 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. . The Transmission Electron Microscope. , (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. . Transmission electron microscopy: physics of image formation. , (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. . Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

GrapheneElectron MicroscopyMammalian CellsLiquid-phaseCell ImagingHER2Antibody MimeticPMMA GrapheneSodium PersulfateSodium Chloride

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image