마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

중추 신경계 (CNS)는 뉴런, glia 및 혈관 관련 세포를 포함한 다양한 상주 세포 유형 간의 상호 작용의 복잡한 상호 작용에 의해 지배된다. 전통적으로 신경세포는 분리, 공동 배양^1,,2,,3,4,4,5(시험관내) 또는 절제된 뇌 조직(ex vivo)^{5 6,,7,,8,,9,,10개의} 문맥에서 연구되었다. 그러나, 생체 내에서 온전한 뇌의 네이티브 환경에서 신경 세포 행동과 상호 작용을 더 이해할 필요가 있다. 이 프로토콜에서, 우리는 관심있는 생체 영역에서 매핑하고 오랜 기간 동안 다양한 CNS 세포 유형 사이의 복잡한 상호 작용을 추적하기 위해 향후 이미징 세션에서 해당 영역을 정확하게 다시 이미지하는 방법을 설명합니다.

생체 내 이미징 접근법의 발달은 신경^{,기능(11,,12,13,14,,}15)의 적절한 이해를 위해 상당한 이득을^{제공했습니다.,} 특히, 이러한 접근 방식은 기존의 체외 및 ex vivo 접근 방식에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 첫째, 생체 내 이미징 시스템은 신경망 생리학의 완전한 이해를 제공하기 위해 세포 상호 작용의 전체 레퍼토리와 혈관과 같은 생리학적으로 관련된 세포 및 조직 성분을 갖는다. 둘째, 최근 연구 결과는 그들의 네이티브 환경에서 제거될 때, 특정 신경 세포 (microglia와 같은)가 생체 내 설정에서 보존될 수 있는 그들의 정체성 및 따라서 생리학^16,,17의 중요한 특징을 분실한다는 것을 건의합니다. 셋째, 생체 내 이미징 시스템은 CNS 세포 상호 작용을 연구하기 위해 몇 주에서 몇 달까지의 안정적인 세로 조사를 위한 기회를 제공합니다. 마지막으로, CNS 생리학에서 말초 면역 계통^18,,19 및 미생물군유전체^20,,21의 기여도에 대한 증가증거를 감안할 때, 생체 내 시스템은 CNS 세포에 대한 그러한 기여와 효과를 심문하는 플랫폼을 제공한다. 따라서, 건강, 부상 및 질병 상태에서 신경 면역 생리학 및 상호 작용을 연구하기 위하여 생체 내 화상 진찰에 있는 세로를 사용하는 접근은 전통적인 접근에 큰 보완적인 추가입니다.

이 프로토콜에서, 우리는 예로 마이크로글리아, 뉴런 및 NG2⁺ 세포를 포함하여 두뇌에 있는 다른 세포 모형을 이미지하는 믿을 수 있는 접근법을 기술합니다. 생체 내 신경 세포를 시각화하는 두 가지 접근법이 개발되었습니다: 얇은 두개골 접근법과 두개골 창 접근법을 가진 열린 두개골. 얇은 두개골 접근법이 사용 중이며 신경교 세포 활성화, 생리학적 척추 역학 및 항 염증제^{22,,23,,24,,25,}얇은 두개골 접근법과 같은 열린 두개골 접근법의 단점 중 일부를 극복하기 때문에 선호되지만 얇은 두개골 접근법은 또한 몇 가지 중요한 단점을 보여줍니다. 첫째, 숱이 절차는 많은 연구원이 재 숱이 필요할 때 특히 완벽하기 어려운 것을 찾아는 아주 섬세한 절차입니다. 이것은 실험자가 두개골을 ~20 μm 깊이로 얇게 했다는 것을 확인하기가 어렵기 때문입니다. 둘째, 마우스 사이의 적절한 비교를 위해, 숱이 동일해야 하고 화상 진찰 세션 또는 마우스 사이 숱이 성공의 다양한 신경 구조물의 시각화를 복잡하게 할 수 있었습니다. 셋째, 세로 화상 진찰에 사용될 때, 얇은 두개골을 가진 동물은 두개골의 재숱이 채택될 때 세션의 제한된 수에만 사용될 수 있습니다. 포스, 뼈 조직의 일부는 여전히 남아 있기 때문에, 이미징의 깊이에 선명도 더 피상적이지만 더 깊은 영역만큼 많은 것을 허용 얇은 두개골 접근에서 손상 될 수 있습니다. 이에 비추어 해마와 같은 더 깊은 뇌 구조는 얇은 두개골 접근법으로 성공적으로 이미지화 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항은 이러한 우려를 극복할 수 있는 대안적이고 보완적인 접근법의 필요성을 제기합니다.

얇은 두개골 접근법에 대한 대안으로, 열린 두개골 창 이식 접근법은 두개골을 광학적으로 맑은 유리 커버슬립으로 대체하는 절차를 사용합니다. 이를 통해 거의 무제한의 이미징 세션을 허용합니다. 더욱이, 유리 커버슬립으로 두개골을 교체하는 것을 감안할 때, 이 방법은 몇 시간에서 달까지 광범위한 기간 동안 형광 태그된 뇌 세포의 명확한 보기 창을 허용하고, 따라서 생리학, 노화 및 병리학과 관련된 세포 활동 및 상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다.

전반적으로, 우리는 관심있는 두뇌 지구의 생체 내 화상 진찰을 가능하게 하는 입체 적인 두개골 절제술을 통해 임플란트 만성 두개골 창을 하기 위하여 따를 수 있는 단계를 상세히 설명합니다. 우리는 또한 어떻게 심하게 안정된 두뇌 혈관 또는 형광으로 표시된 원더라이트가 관심있는 두뇌 지구의 각각 거친 또는 미세지도를 생성하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명합니다. 이 접근 은 다음 여러 세션에 반복 된 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 기술의 중요성은, 그러므로, 다른 세포 모형의 배열, 형태학 및 상호 작용을 포함하여 두뇌 요소에 있는 장기 변경 또는 정지를 이미지하는 기능에 있습니다.