מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.
Abstract
מערכת העצבים המרכזית (CN) מוסדר על ידי הגומלין מורכבים של הנוירואליות, glial, סטרומה, ובתאי כלי דם המאפשרים את תפקידה התקין. למרות שלומדים תאים אלה בבידוד בחוץ-גופית או ביחד לשעבר vivo מספק מידע פיזיולוגי שימושי; תכונות בולטות של פיזיולוגיה התא העצבי יהיה לפספס הקשרים כאלה. לכן, יש צורך ללמוד תאים עצביים הילידים שלהם בסביבה vivo. הפרוטוקול מפורט כאן מתאר חוזר ונשנה ב vivo שני פוטון הדמיה של תאים עצביים בקליפת מכרסם ככלי כדי להמחיש וללמוד תאים ספציפיים על פני תקופות ממושכות של זמן משעות לחודשים. אנו מתארים בפרוטרוט את השימוש במוח יציב בצורה גסה ובאופן מחוספס כמפה גס או מתויג הדנדריטים הדנדטים כמפה יפה של אזורי המוח הנבחרים של עניין. באמצעות מפות אלה כמפתח חזותי, אנו מראים כיצד התאים העצביים יכול להיות מועבר בדיוק עבור חוזרות ונשנות של vivo הדמיה. באמצעות דוגמאות של הדמיה vivo של מיקרוגליה מתויג, נוירונים, ו NG2+ תאים, פרוטוקול זה מדגים את היכולת של טכניקה זו כדי לאפשר הדמיה חוזרת של דינמיקה הסלולר באותו מיקום המוח על פני תקופות זמן ממושכות, כי יכול לסייע עוד יותר בהבנת התגובות מבניים ופונקציונלי של תאים אלה בפיזיולוגיה נורמלית או לאחר עלבונות פתולוגיים. במידת הצורך, גישה זו יכולה להיות משולב הדמיה תפקודית של תאים עצביים, למשל, עם הדמיה סידן. גישה זו היא במיוחד טכניקה רבת עוצמה כדי להמחיש את האינטראקציה הפיזית בין סוגי תאים שונים של ה-CN ב vivo כאשר מודלים של עכבר גנטי או צבעים ספציפיים עם תגי פלורסנט ברורים כדי לתייג את תאי העניין זמינים.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית (CN) נשלטת על ידי הגומלין המורכבים של אינטראקציות בין סוגי תאים שונים הכוללים נוירונים, גליה ותאים המשויכים לספינה. באופן מסורתי, התאים העצביים נחקרו בבידוד, שיתוף תרבותי1,2,3,4,5 (בתוך מבחנה) או ברקמת מוח מחפירה (ex vivo)6,7,8,9, 10 ההקשרים10 . עם זאת, יש צורך להבין עוד התנהגות התא העצבי ואינטראקציות בסביבה הטבעית של המוח שלם בvivo. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה למפות באזורים vivo מעניינים ולשחזר בדיוק את האזורים האלה בהפעלות הדמיה עתידיות כדי לעקוב אחר האינטראקציות המורכבות בין סוגי תאי ה-CN השונים בפרקי זמן ארוכים.
התפתחות בגישות הדמיה vivo סיפקה רווחים משמעותיים עבור הבנה נכונה של תפקוד עצבי11,12,13,14,15. באופן ספציפי, גישות אלה מספקות מספר יתרונות על פני המסורתית בגישות מחוץ לvivo ולשעבר. ראשית, במערכות הדמיה vivo יש מבחינה פיזיולוגית רכיבים סלולריים ורקמות כגון ואצלב עם הרפרטואר המלא של אינטראקציות סלולריות כדי לספק הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של הרשת העצבית. שנית, ממצאים אחרונים מראים כי כאשר הוסרו מן הסביבה הטבעית שלהם, תאים עצביים מסוימים (כגון microglia) לאבד תכונות חשובות של זהותם ולכן פיזיולוגיה16,17 אשר ניתן לשמור בvivo בהגדרה. שלישית, במערכות הדמיה vivo לספק את ההזדמנות לחקירות האורך יציבה של שבועות עד חודשים כדי ללמוד אינטראקציות הסלולר של ה-CN. לבסוף, בהינתן הראיות ההולכות וגדלות עבור תרומות ממערכת החיסון ההיקפית18,19 ו-microbiome20,21 ב הנוירופיזיולוגיה, ב vivo מערכות לספק פלטפורמה לחקור תרומות כאלה ואפקטים על תאי הבסיס. לפיכך, גישות העושות שימוש אורכי בהדמיה הvivo לחקר הפיזיולוגיה החיסונית והאינטראקציות של מדינות בריאות, פצועים ומצבים נגועים הם תוספת משלימה מאוד לגישות המסורתיות.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה מהימנה לתמונה סוגי תאים שונים במוח כולל microglia, נוירונים ו NG2+ תאים כדוגמאות. שתי גישות להמחיש את תאי העצבים בvivo פותחו: גישת הגולגולת הדקה והגולגולת הפתוחה עם גישה לחלון הגולגולת. למרות הגישות הגולגולת דיללו נמצאים בשימוש והם העדיפו כי הם להתגבר על כמה חסרונות של גישה הגולגולת הפתוחה כגון הפעלת התא גליה, גבוה יותר מאשר הדינמיקה של עמוד השדרה והשימוש של סוכנים אנטי דלקתיות22,23,24,25, הגולגולת דיללו גישות גם להראות כמה חסרונות קריטיים. ראשון, ההליך דליל הוא הליך עדין מאוד, כי חוקרים רבים למצוא קשה למושלם במיוחד כאשר מחדש דליל הוא הכרחי. זה המקרה כי זה לעתים קרובות קשה לניסויים כדי לוודא כי יש להם לדבר את הגולגולת לעומק ~ 20 יקרומטר. שנית, עבור השוואות נאותה בין עכברים, דליל צריך להיות זהה מגוון של הצלחות דליל בין הפעלות הדמיה או עכברים יכול לסבך ויזואליזציה של מבנים עצביים. שלישית, כאשר מועסק עבור הדמיה האורך, בעלי חיים עם גולגולות דיללו ניתן להשתמש רק עבור מספר מוגבל של הפעלות כאשר מחדש דליל של הגולגולת מועסק. בנוסף, מאז חלק רקמת העצם עדיין נשאר, בהירות בעומק של הדמיה יכול להיות נפרץ מפני גישה הגולגולת דיללו המאפשר ויזואליזציה גדולה של שטחי יותר, אבל לא כמו עם אזורים עמוקים יותר. לאור זה, מבנים במוח עמוק יותר כגון ההיפוקמפוס, לא ניתן לבצע התמונה בהצלחה עם גישה הגולגולת דיללו. שיקולים אלה מעלים את הצורך בגישות חלופיות ומשלימות העלולות להתגבר על החששות הללו.
חלופה גישה הגולגולת דיללו, הגישה הפתוחה הגולגולת החלון משתמשת בהליך שבו הגולגולת מוחלף עם שמיכות זכוכית ברורה אופטית. הדבר מאפשר מספר קרוב-בלתי מוגבל של הפעלות דימות. יתר על כן, בהתחשב החלפת הגולגולת עם שמיכות זכוכית, שיטה זו מאפשרת חלון צפייה ברור של כדוריות המוח מתויג fluorescently לתקופות נרחבות של פעמים משעות עד חודשים, ולכן, יכול להיות מועסק כדי ללמוד פעילות תאים ואינטראקציות הרלוונטיות לפיזיולוגיה, הזדקנות פתולוגיה.
באופן כללי, אנו פירוט צעדים שניתן לעקוב אחר לעשות השתל חלונות גולגולת כרונית באמצעות פתיחת גולגולת סטריאוטקאית המאפשרת הדמיה vivo של אזורי המוח של עניין. כמו כן נתאר כיצד המוח היציב בצורה גסה ובעל הדנדריטים המסומנים בעזרת הדנדטים יכולים לשמש להפקת מפה מחוספס או משובח, בהתאמה לאזורי המוח של העניין. גישה זו יכולה לשמש להדמיה חוזרת על פני מספר מפגשים. החשיבות של טכניקה זו, לפיכך, טמונה ביכולתה לדמות את השינויים לטווח הארוך או הקיפאון במרכיבי המוח, כולל ההסדר, המבנה והאינטראקציות של סוגי הסלולר השונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הופעתו של vivo שני פוטון הדמיה פתחה הזדמנויות לחקור שפע של אינטראקציות סלולר ודינמיקה המתרחשים במוח בריא. המחקרים הראשוניים התמקדו בשימוש בגישת הגולגולת הפתוחה לגלונטיס של התמונה באמצעות דימות כרוני ואקוטי37,38. זה יכול לשמש גם כדי להבהיר אינטראקציות נוירוחי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת Eyo על הדיון ברעיונות המוצגים בכתב יד זה. אנו מודים לד ר ג’סטין רוסטנבן ממעבדת קיפניס באוניברסיטת וירג במתנה של עכברים NG2Sred 33. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ של המכון הלאומי לבריאות כדי U. B. E (K22 NS104392).
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. 神经科学. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
