Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris
Summary
Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.
Abstract
Nous décrivons la procédure étape par étape pour cultiver et différencier les cellules souches embryonnaires de souris en lignées neuronales, suivie d’une série de tests pour caractériser les cellules différenciées. Les cellules souches embryonnaires de souris E14 ont été utilisées pour former des corps embryoïdes par la méthode de la goutte suspendue, puis induites à se différencier en cellules progénitrices neurales par l’acide rétinoïque, et enfin différenciées en neurones. Des expériences quantitatives de réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-qPCR) et d’immunofluorescence ont révélé que les progéniteurs neuronaux et les neurones présentent des marqueurs correspondants (nestin pour les progéniteurs neuronaux et neurofilament pour les neurones) aux jours 8 et 12 après la différenciation, respectivement. Des expériences de cytométrie en flux sur une ligne E14 exprimant un rapporteur GFP piloté par le promoteur Sox1 ont montré qu’environ 60% des cellules au jour 8 sont GFP positives, indiquant la différenciation réussie des cellules progénitrices neurales à ce stade. Enfin, l’analyse ARN-seq a été utilisée pour profiler les changements transcriptomiques globaux. Ces méthodes sont utiles pour analyser l’implication de gènes et de voies spécifiques dans la régulation de la transition de l’identité cellulaire au cours de la différenciation neuronale.
Introduction
Depuis leur première dérivation à partir de la masse cellulaire interne des blastocystes de souris en développement1,2,les cellules souches embryonnaires de souris (CSM) ont été utilisées comme outils puissants pour étudier l’auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches3. En outre, l’étude de la différenciation des CSM conduit à une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires qui peuvent améliorer l’efficacité et la sécurité de la thérapie à base de cellules souches dans le traitement de maladies telles que les troubles neurodégénératifs4. Par rapport aux modèles animaux, ce système in vitro offre de nombreux avantages, notamment la simplicité dans la pratique et l’évaluation, le faible coût de maintien des lignées cellulaires par rapport aux animaux et la facilité relative des manipulations génétiques. Cependant, l’efficacité et la qualité des types de cellules différenciés sont souvent affectées par différentes lignées de cSM ainsi que par les méthodes de différenciation5,6. En outre, les tests traditionnels pour évaluer l’efficacité de la différenciation reposent sur un examen qualitatif de gènes marqueurs sélectionnés qui manquent de robustesse et ne parviennent donc pas à saisir les changements globaux dans l’expression des gènes.
Ici, nous visons à utiliser une batterie de tests pour l’évaluation systématique de la différenciation neuronale. En utilisant à la fois des analyses in vitro traditionnelles sur des marqueurs sélectionnés et des séquençages d’ARN, nous établissons une plate-forme pour mesurer l’efficacité de la différenciation ainsi que les changements transcriptomiques au cours de ce processus. Sur la base d’un protocole précédemment établi7,nous avons généré des corps embryoïdes (EB) grâce à la technique de la goutte suspendue, suivie d’une induction utilisant une quantité supraphysiologique d’acide rétinoïque (PR) pour générer des cellules progénitrices neurales (NPC), qui ont ensuite été différenciées en neurones avec un milieu d’induction neuronal. Pour examiner l’efficacité de la différenciation, en plus des tests traditionnels de RT-qPCR et d’immunofluorescence (FI), nous avons effectué une cytométrie d’ARN-seq et de cytométrie en flux. Ces analyses fournissent une mesure complète de la progression de la différenciation spécifique au stade.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris est établie depuis des décennies et les chercheurs ont continué à modifier les protocoles précédents ou à en créer de nouveaux à des fins diverses7,10,11. Nous avons utilisé une série de tests pour analyser de manière exhaustive l’efficacité et la progression des étapes de différenciation des CSM en neurones, qui peuvent être…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (1R35GM133496-01) à Z. Gao. Nous tenons à remercier le Dr Ryan Hobbs pour son aide dans le sectionnement. Nous remercions les installations de base du Penn State College of Medicine, notamment les sciences du génome et la bioinformatique, l’imagerie par microscopie optique avancée et la cytométrie en flux. Nous remercions également le Dr Yuka Imamura pour son aide dans l’analyse de l’ARN-seq.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
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