Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

JoVE Journal > Biochemistry

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生物化学

양상추 품종(Lactuca sativa L.) 및 작물 야생 친척(Lactuca spp.) 비타민 C의 정량화를위한 향상 UPLC-UV 방법

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

우리는 LACtuca spp에서 비타민 C를 정량화하는 빠르고 신뢰할 수있는 방법을 제시합니다. 주요 단계는 안정적인 조건에서 시료 준비 및 비타민 C 추출, 아스코르브 산에 탈수 액상 코르빅 산의 감소 및 크로마토그래피 절차의 최적화입니다.

Abstract

비타민, 특히 비타민 C는 과일과 채소에서 발견되는 중요한 미량 영양소입니다. 비타민 C는 또한 그들의 항 산화 능력에 주요 기여. 양상추는 전 세계 소비자들 사이에서 가장 인기있는 채소 중 하나입니다. 양상추 및 기타 관련 종의 비타민 C 함량을 측정하는 정확한 프로토콜이 중요합니다. 여기서는 샘플 준비, 비타민 추출 및 크로마토그래피 조건이 최적화된 초고성능 액체 크로마토그래피-자외선(UPLC-UV) 기법을 사용하는 방법을 설명합니다.

샘플은 전체 식물을 나타내기 위해 수집되었고, -80°C에서 동결되고 바람직하지 않은 산화를 방지하고 조작을 더 쉽게 하기 위해 lyophilized하였다. 비타민 C의 추출은 산성 매체에서 수행되었으며, 이는 또한 안정성에 기여했습니다. 비타민 C는 두 가지 상호 변환 가능한 형태, 아스코르브산 (AA) 및 탈수액 코르빅 산 (DHAA)에서 존재할 수 있기 때문에 두 화합물을 정확한 정량화를 위해 측정되어야합니다. AA는 스펙트럼의 UV 범위에서 DHAA보다 더 높은 흡수성을 나타내기 때문에 DHAA가 AA로 환원 한 후 간접적으로 정량화되었다. 동일한 추출물에서, 2개의 측정이 수행되었다, 그 감소 반응 후 하나. 첫 번째 경우, 우리는 AA 함량을 정량화하고, 두 번째에, 우리는 AA와 DHAA의 합계를 정량화했다 (TAA : 총 아스코르빅 산) AA의 형태로. 이어서, DHAA 양은 TAA로부터의 첫 번째 측정에서 오는 AA를 빼서 간접적으로 수득하였다. 그들은 UPLC-UV에 의해 결정되었다, 교정 곡선을 구축하고 크로마 토그래피 절차를 최적화하기 위해 상용 AA 표준을 사용하여, 완전히 짧은 시간에 해결 된 AA 피크를 얻기 위해. 이 프로토콜은 약간의 변화가 없는 다른 플랜트 재료로 쉽게 추정될 수 있습니다. 그 정확도는 통계적으로 유의한 차이가 그렇지 않으면 인식되지 않은 것으로 나타났습니다. 다른 강점과 한계는 원고에서 더 깊이 논의된다.

Introduction

재배양상추(Lactuca sativa L.)는 2018년 약 2,730만 톤의 생산량으로 전 세계적으로 가장 많이 생산되고 소비되는 잎채소 중^{하나입니다.} 양상추는 소비자에 의해 건강으로 인식됩니다. 영양 학적 특성은 주로 폴리페놀과 비타민 E^2와같은 다른 사람의 사이에서 비타민 C와 같은 작물의 항산화 화합물의 공급원에 기인한다. 비타민 C는 다른 많은 척추동물과 달리 인간에게 필수적인 미량 영양소이며, 생합성 경로^3에서마지막 단계 효소를 코딩하는 유전자에 존재하는 돌연변이로 인해 생성할 수 없기 때문이다. 정상적인 세포 대사에 필요하며 주로 항산화 활성^3,^4로인해 면역 반응에 중요한 역할을 한다.

총 비타민 C는 아스코르브산(AA) 및 탈수액성코르브산(DHAA)으로 구성됩니다. AA는 가장 생물학적으로 활동적인 형태의 비타민이지만 DHAA(산화 제품)도 생물학적 활성을 나타내며 인체에서 AA로 쉽게 변환할 수^{있다 5.} 따라서, 두 가지 형태를 정량화하는 것은 모든 원예 작물, 양상추 포함의 총 비타민 C 함량을 결정하는 것이 중요하다.

효소, 분광광측정, 및 titrimetric 방법^6,^7,^8과같은 채소에서 비타민 C를 측정하는 다양한^접근법이사용되어 왔다. 이러한 방법은 간단하지만 AA^9에대해 화학적으로 구체적이지 않습니다. 따라서, 크로마토그래피 방법은 특히 고성능 액체 크로마토그래피-자외선(HPLC-UV) 기술이 더 높은^{정확도(10)를}선호한다. HPLC-UV는 브로콜리, 시금치 및 양상추^11,^12,^13과같은 작물의 큰 다양성에서 비타민^C를결정하는 데 사용되었습니다. 그러나, AA와 DHAA의 동시 정량화는 스펙트럼의 UV 범위에서 DHAA의 낮은 흡수성 으로 인해 복잡하다. 대안적으로, DHAA는 DHAA를 AA로 변환하는 환원제를 사용하여 총 아스코르빅산(TAA)을 측정한 다음 TAA와 AA의 차이를 계산함으로써 간접적으로 결정될 수 있다. 감소 반응의 필요성으로 인해 일부 연구에서는 AA만^14을정량화하여 실제로 비타민 C 활성의 과소 평가를 나타낼 수 있습니다. 그 추가 감소 반응은 또한 액체 크로마토그래피 기술의 마지막 전진이 사용되는 경우에도 간접적으로 DHAA를 결정하기 위해 필요합니다, 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC), 사용된다. 이 단계는 또한 UPLC가 HPLC에 비해 전시하는 이점의 이점, 즉 높은 효율성과 해상도, 감도 향상, 짧은 시간 분석 및 낮은 용매 소비^15. 그 결과, UPLC-UV 기술은 다른^{작물(16)에서}비타민 C를 정량화하는 데 활용되고 있다.

또한, AA는 매우 음순 분자; 따라서 양상추 저장 및 비타민 C 분석⁹에서 분해를 방지하는 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다. 이러한 맥락에서, 다음 프로토콜은 UPLC-UV에 의한 양상추에서 비타민 C 함량의 신속하고 향상된 정량화뿐만 아니라 효율적인 추출 절차를 제공합니다. 뿐만 아니라 엘리트 품종은 현재 연구에 포함 되었습니다., 뿐만 아니라 전통적인 육지 경주와 일부 야생 친척 작물 사육에 그들의 잠재적인 관심으로 인해, 특히 양상추의 영양가의 개선에.

Protocol

1. 식물 재료 준비 50mL 폴리프로필렌 튜브, 외부(이전) 및 내부(younger) 1개로 식물당 적어도 2개의 잎을 시료하여 전체 식물을 보다 정확하게 표현한다. 각 샘플에 대해 적어도 3개의 생물학적 복제를 수집합니다. 액체 질소를 사용하여 즉시 얼리고 사용할 때까지 -80 °C에 보관하십시오. 액체 질소가 튜브에 들어가지 않는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 기화 시 가스 팽창으로 인해 제거될 때 폭발할 수 있습니다.주의: 액체 질소 사용과 관련된 잠재적 인 위험으로 인해 장갑과 얼굴 보호막이 필요합니다. 튜브에서 캡을 제거하고 다음과 같이 프로그래밍된 lyophilizer(재료표)의동결 건조기 챔버 내의 트레이에 배치합니다: -25°C 72h, -10°C는 10시간, 10시간 동안 0°C, 20°C 이상 4h. 동결 건조 공정 동안 응축기 온도 및 진공 상수를 각각 -80.2°C 및 112 mTorr에서 유지합니다. 재료가 완전히 건조할 때(식물및 튜브 내의 다짐 정도에 따라 4일 에서 7일 사이), 4°C, -20°C 또는 -80°C에서 짧은(일에서 주), 중간(월) 또는 긴(년) 저장으로 각각 보존한다. 샘플 포함 튜브에 실리카 젤 구슬이 들어 있는 가방을 포함시키는 것이 좋습니다. lyophilized 샘플을 20 mL 폴리 프로필렌 튜브에 10mm 직경스테인 스틸 볼과 함께 넣고 미세 먼지를 얻는 데 필요한 강도와 시간을 사용하여 멀티 튜브 소용돌이로 갈아 냅니다.참고: 전체 프로세스 동안 직접 조명에 노출되지 않도록 샘플을 보호합니다. 2. 시약 및 솔루션 준비 용매 추출 용액 준비: 8% 아세트산(v/v), 1% MPA(메타-인산) (w/v), 1 mM EDTA(에틸렌디아민트라아세산). 5mL가 각각 추가된다는 점을 고려하여 전체 샘플 집합을 처리하는 데 필요한 용매의 총 볼륨을 계산합니다. 용액 의 1 L을 준비하려면, 플라스크에 추가 : MPA의 30g, EDTA 탈수의 0.372 g, 아세트산 80 mL 및 초순수 의 500 mL (그에 따라 스케일 볼륨 및 수량). 플라스크 입을 플라스틱 필름으로 밀봉합니다. 자기 교반기의 도움으로 용해되면, 정확하게 1 L을 측정하기 위해 체적 플라스크를 사용하여 필요한 초순수수를 추가합니다. 환원 반응 버퍼(0.5M Tris(2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올) pH 9.0) 및 환액(40mM DTT(1,4-디티오트레이톨) 0.5M Tris pH 9.0)을 준비한다. 200 μL이 각각에 추가될 것이라는 점을 고려하여 전체 샘플 집합을 처리하는 데 필요한 총 감소 솔루션의 양을 계산합니다. 버퍼의 100mL를 준비하려면, 비커에 추가 : 트리의 6.055 g와 초순수 의 90 mL (그에 따라 스케일 볼륨 및 수량). 플라스틱 필름으로 비커 입을 밀봉합니다. 자기 교반기의 도움으로 용해되면 2 M HCl을 추가하여 pH 9.0으로 용액을 조정하고 체피 플라스크를 사용하여 100 mL을 정확하게 측정하여 필요한 초순수 수를 추가하십시오. 100mL의 환원 용액을 준비하려면 비커에 추가하십시오: 0.629 g의 DTT (순도: 98%) 버퍼의 90mL (0.5 M Tris pH 9.0) 이전에 준비 (2.2.1 ~ 2.2.2). 그에 따라 볼륨과 수량을 배율조정합니다. 플라스틱 필름으로 비커 입을 밀봉합니다. 자기 교반기의 도움으로 용해되면 볼륨 플라스크를 사용하여 100 mL을 정확하게 측정하여 필요한 버퍼 0.5 M Tris pH 9.0을 추가하십시오.참고: 감소 솔루션은 매우 불안정합니다. 그래서 갓 만든 솔루션을 강력하게 권장합니다. 황산 (0.4 M H2SO4) 각각 200 μL이 추가된다는 점을 고려하여 전체 시료 집합을 처리하는 데 필요한 총 0.4M 황산의 총 부피를 계산합니다. 용액의 100mL를 준비하려면 비커에 추가하십시오 : 80 mL의 초순수 수와 H2SO4의 2.22 mL (순도 : 96 %, 밀도 : 1.84 g mL-1). 체피 플라스크를 사용하여 100mL를 정확하게 측정하여 필요한 초순수수를 추가합니다.주의: 황산은 매우 부식성이 있으므로 보호 장비를 사용하고 후드 아래에 처리해야합니다. 또한, 산은 연기를 줄이고 사고를 피하기 위해 산에 물이 아닌 초순수물에 첨가되어야 한다. 염산 (2 M HCl). 2M 염산의 100mL를 준비하려면 비커에 추가하십시오 : 80 mL의 초순수 수와 HCl6.13 mL (순도 : 37 %, 밀도 : 1.19 g mL-1). 플라스틱 필름으로 비커 입을 밀봉합니다. 체피 플라스크를 사용하여 100mL를 정확하게 측정하여 필요한 초순수수를 추가합니다. 그에 따라 볼륨을 배율.주의: 염산은 매우 부식성이 있으므로 보호 장비를 사용하고 후드 아래에 처리해야합니다. 또한, 산은 연기를 줄이고 사고를 피하기 위해 산에 물이 아닌 초순수물에 첨가되어야 한다. AA 표준(재고 및 희석) 정확히 무게 10 AA 표준의 mg (순도: 99%) 정밀 저울을 사용하여 90mL의 이동상(포믹산을 사용한 초순수물 pH 2.0)을 추가합니다. 자기 교반기의 도움으로 용해되면, 정확하게 100 mL을 측정하기 위해 체피 플라스크를 사용하여, 포믹 산과 초순수 물 pH 2.0의 필요한 볼륨을 추가.참고: 빛에 노출되지 않도록 이 스톡 솔루션을 보호합니다. 표 1의 지침에 따라 교정 곡선을 얻고 5.2 단계로 진행하기 위해 AA 표준의 재고로부터 5개의 희석을 준비한다. 표준 [AA] (μg mL-1) AA(100 μg mL-1)용액(μL) 이동상(μL) 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 a 포믹산에 의해 산성화된 초순수수 pH 2.0. 표 1: AA(아스코르브산)의 5가지 표준을 준비하는 프로토콜. 표준의 상이한 농도를 각각 준비하는 솔루트 및 용매의 부피가 표시됩니다. 3. AA 및 DHAA 추출 참고: 추출 단계 동안 저조도 조건에서 작업하는 것이 좋습니다. 15mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브에, 50 mg의 용성 접지 샘플과 추출 용매의 5mL(단계 2.1)를 추가한다. 5s에 대한 소용돌이를 사용하여 혼합물을 흔들고 2000 rpm에서 10 분 동안 궤도 셰이커를 흔들어. 초음파가 활성화된 실온에서 10분 동안 초음파 욕조에 튜브를 도입합니다. 4°C에서 10분 동안 4,000 x g의 원심분리기. 상체를 가지고 0.22 μm 재생 셀룰로오스 필터를 통과하고 5mL 호박 유리병에 저장합니다. 이것은 AA와 DHAA를 포함하는 추출물 1입니다.참고: 이 프로토콜은 -80°C에서 추출물을 동결하고 AA 및 DHAA가 빛의 존재, 고온 또는 산화 대기 하에서 쉽게 저하되기 때문에 빛에 노출되지 않도록 보호함으로써 여기서 일시 중지될 수있다(보충 파일 1). 4. TAA를 추출하기 위해 AA로 DHAA 감소 액체 크로마토그래피를 위해 추출물 1의 200 μL을 2mL에 2mL의 황색 유리병을 옮기고 환원 용액의 200 μL을 추가합니다(단계 2.2). PTFE-실리콘 플러그로 바이알을 사전 개구부로 닫고 5s용 소용돌이로 흔들어줍니다. 용액이 실온에서 30 분 동안 서서 빛으로부터 보호 할 수 있습니다. 0.4 M H2SO4의 200 μL을 추가하여 반응을 멈추고 산성 pH에서 AA를 안정화시하십시오. 결과 솔루션은 AA만 포함하고 실제로 TAA인 추출 2입니다. 5. 결정 UPLC-UV 준비 표 2에설명된 작업 솔루션을 준비하여 0.22 μm 필터를 적절하게 필터링하고 최소 10분 동안 초음파 처리하여 UPLC 시스템에 배치합니다. 세 개의 UPLC 모듈을 켜고 내부 교정 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다. 소프트웨어를 열고 (예를 들어, 3) 표 2에설명 된 악기 프로그램을로드 : 권한 3 | 샘플 실행 | 비타민 C 방법 | UPLC_PDA | 퀵스타트 사용. 소프트웨어가 올바른 프로그램으로 로드되면 UPLC 관리 콘솔에 액세스하십시오: 쿼터터얼 솔벤트 매니저 | 마우스 오른쪽 버튼을 클릭 | 콘솔을 실행합니다. UPLC 계측기의 준비 및 안정화로 진행: 시스템 | 제어 | 시작. 최소 5분 동안 모든 UPLC 라인을 제거: 프라임 솔벤트 | QSM | A, B, C, D 및 씰 워시 확인 | 프라임 > 5 분 의 기간. 주입기 청소 및 청소: 프라임 솔벤트 | SM | 세척 용매(> 45s)와 체크 퍼지 용매(> 35사이클)를 확인한다. 방법 조건에 UPLC를 평형 : 방법과 평형 | QSM | 흐름 (0.3 mL 분-1)| 용매 A (2%) | 용매 B (0%) | 용매 C (98%) | 용매 D (0%); 방법과 평형 | SM | 샘플 (5 °C) | 컬럼(30°C) 및 방법 과 동등 | 기타 | 램프 켜기 확인 | 시작 을 누릅니다. 장비가 안정화될 때까지 최소 1시간(더 많은 시간이 권장)을 기다립니다. 안정성은 발사 콘솔의컬럼의 압력을 확인할 수 있습니다 : 시스템 | 쿼터니 솔벤트 매니저 | QSM 시스템 압력. 압력 변화에 식별 가능한 추세(증가 또는 감소)가 없고 델타 값이 10psi 미만인지 확인합니다. QuickStart 화면에서 분석할 표준 및 샘플의 이름으로 행렬을 채웁니다. 표준의 AA 결정 액체 크로마토그래피를 위해 이전에 준비된 5개의 AA 표준(단계 2.5.3)에서 2mL 호박 바이알각각의 1mL를 전송합니다. PTFE-실리콘 플러그로 유리병을 사전 개구부로 닫고 UPLC 기기에 5 μL을 주입합니다. 표 2에 기술된 절차에 따라 대부분의 희석에서 대부분 농축된 것으로 시작하여 크로마토그래피를 수행하십시오. 샘플의 AA 결정 액체 크로마토그래피를 위한 2mL 호박 병병에 추출 1의 파이펫 200 μL및 초순수 수의 800 μL을 추가합니다. PTFE-실리콘 플러그로 유리병을 사전 개구부로 닫고 UPLC 기기에 5 μL을 주입합니다. 표 2에기술된 절차에 따라 크로마토그래피를 수행한다. 샘플의 TAA 결정 추출 2에 400 μL의 초순수물을 추가합니다. PTFE-실리콘 플러그로 유리병을 사전 개구부로 닫고 UPLC 기기에 5 μL을 주입합니다. 표 2에기술된 절차에 따라 크로마토그래피를 수행한다. 구성 요소 및 매개 변수 설명 악기 무죄 UPLC H 클래스 탐지기 AA=245 nm용 PDA 에프론티어 검출기 λabs 소프트웨어 3권한 부여 열 무죄 UPLC HSS T3 (150mm x 2.1 mm x 1.8 μm) 채널 A CH3OH 채널 B/워시 H2O:CH3OH (50:50 v) 채널 C 포믹산에 의해 산성화된 초순수물 pH 2.0 채널 D/씰 워시 초순수:아세토닐릴 (90:10 v: v) 모바일 단계 0.3 mL 분-1 의 2% A + 98%C (동위 원소 모드) 열 온도 30°C 자동 샘플러 온도 5 °C 사출 볼륨 5 μL AA 보존 시간 1.874분 실행 시간 3분 a pH 조정까지 사용되는 포믹산의 미정 부피 표 2: 상추와 야생 친척의 추출물에서 AA(아스코르브산)를 결정하기 위해 최적화된 크로마토그래피 시술. 사용되는 구성 요소, 조건 및 솔루션에 대한 설명입니다. 6. AA 및 DHAA의 정량화 통계 분석 베르톨린 외18 (표 3)에의해 설명된 바와 같이 크로마토그래피 방법의 분석 파라미터를 결정한다.참고: 표 3에 제시된 매개 변수의 값은 특정 실험 조건하에서 정의되어야 합니다. 메서드의 분석 매개 변수 값 선형 범위(μg mL-1) 0.5-25 선형 방정식 y=53,143.03x R2 0.99998 검출 한계(건조 물질의 Mg AAg-1) 0.013 정량화 제한(건조 물질의 Mg AAg-1) 0.045 반복성(CV,%) 1.75 중간 정밀도(CV,%) 4.22 복구(Rec, %)b 95.6±2.4 a 이력서: 변화의 계수 b 복구 분석은 동일한 샘플 50 mg을 포함하는 10 개의 알리쿼트, 5 개의 건조 물질 2 mg의 AA g-1 및 5 비 스파이크로 수행되었습니다. %Rec=([AA]스파이크 샘플-[AA]샘플)/([[AA]스파이크)x100. 표 3: AA(아스코르브산) 및 TAA(총 아스코르브산)의 검출 및 정량화를 위한 최적화된 분석 파라미터. 선형 범위, 방정식 및 교정(R2)곡선의 측정 계수는 AA(TAA와 동일)의 검출 및 정량화의 한계뿐만 아니라, 반복성, 중간 정밀도 및 회수는 5μL의 시료 사출 부피로 얻어졌다. AA 및 TAA 농도를 계산합니다. 표준 및 샘플 크로마토그램 열기: 퀵스타트 | 프로젝트 찾아보기 | 채널 | “표준 또는 샘플이름” | PDA Ch1 245 nm@1.2 nm. 시작점(약 1.790분)을 클릭하고 마우스로 드래그하여 표준 및 샘플에 해당 피크(AA 또는 TAA)를 통합합니다(약 1.910분). 위에 제조된 5개의 AA 표준의 농도에 대하여 크로마토그래피(step 5.2.) 결정된 흡광도 값을 나타내는 교정 곡선을 구축한다(표1). 5.3 및 5.4 단계에서 결정된 샘플의 흡광도 값을 보간하고 각각 다음과 같은 공식으로 AA 및 TAA 농도를 얻습니다.여기서 y는 통합피크 영역이고, x는 Ppm 및 m 및 n의 AA 또는 TAA 농도가 각각 얻어진 회귀 선의 경사 및 y-intercept이다. DHAA의 농도를 계산하기 위해 다음 공식을 적용하십시오.참고: 건조 중량의 mgg-1에서 DHAA, AA 및 TAA의 총 농도를 얻으려면 교정 곡선에서 직접 보간된 값은 총 추출물 부피 및 희석 계수를 곱한 다음 추출을 수행하는 데 사용되는 샘플의 무게로 나누어져야 합니다.

Representative Results

Lactuca 매트릭스의 비타민 C 정량화는 신뢰할 수 있는 결과를 보장할 수 있는 크로마토그래피 접근법의 개발이 필요합니다. 도 1A는 미확인 미성년자 “어깨”와 함께 AA 피크를 제시하는 최적화되지 않은프로토콜(보충 파일 2)에서유래한 크로마토그램을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 추출 및 크로마토그래피 조건을 개선한 후, 알 수 없는 화합물의 간섭 없이 해결된 AA 피크를 달성하였다(도1B). 또한, HPLC-UV 대신 UPLC-UV 장비를 사용하면 최적화된 크로마토그램에서 1.874분 대 2.980분(그림1)및 실행 시간, 최적화및 비최적화 프로토콜을 각각 3및 7분 으로 줄일 수 있었습니다. 그림 1: 동일한 양상추 샘플에서 AA의 크로마토그램(상업용 품종 ‘베고냐’). (A)최적화되지 않은 프로토콜(보충 파일 2에 설명된 조건)에서 발생하는 HPLC-UV 크로마토그램. (B)최적화된 프로토콜(표 2에기술된 조건)으로 얻은 UPLC-UV 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 1A에서관찰된 것과 같은 AA 피크의 간섭은 겹치는 피크 영역이 그들 사이의 가장 깊은 지점에서 수직 낙하에 의해 통합되었기 때문에 크로마토그래피 과정에서 분리가 부족하여 일관되게 비타민 C(AA, DHAA 및 TAA) 함량(도2)의과소 평가되는 결과를 낳았다. 이러한 바이어스는 작물 야생 친척의 경우 특히 DHAA 및 TAA함량(그림 2)에서특히 두드러지다. 그림 2: 비타민 C의 함량 분포. 상업 및 전통적인 양상추 품종과 비 최적화 된 프로토콜을 사용하여 일부 야생 친척에서 DHAA, AA 및 TAA 함량 (건조 중량의 mg g-1)의 바이올린 플롯을 분할합니다. 검은색 선은 평균 값을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 더욱이, 최적화되지 않은 프로토콜을 사용하면 양상추와 야생 친척 의 모든 유형이 비슷한 비타민 C 함량을 갖는 모든 샘플을 보여주었기 때문에 결과에서 유용한 결론을 추출할 수 없었습니다. 대조적으로, 최적화된 프로토콜을 통해 DHAA 및 TAA 함량(표4)에대해 통계적으로 유의한 차이를 검출할 수 있었고, 가장 부유한 분들은 야생종(그림2)이다. 최적화되지 않은 최적화 F 비율 p-값 F 비율 p-값 DHAA 0.460 0.637ns 5.613 0.009** Aa 0.070 0.932ns 1.020 0.374ns Taa 0.015 0.985ns 4.438 0.022* ns, * 및 ** p<0.05 및 0.01에서 중요하지 않고 중요한 것을 각각 나타냅니다. 표 4: 비타민 C의 함량 변동. DHAA, AA 및 TAA 콘텐츠에 대한 F-비율(두 가지 분산의 지수, 그룹 간 분산 및 그룹 내 분산)과 일방통행 ANOVA의 중요성 값(상업용 양상추 품종, 전통적인 양상추 품종 및 작물 야생 친척)의 유형은 최적화되지 않고 최적화된 프로토콜로 고려됩니다. 보충 파일 1 : 24 시간 이상 5 °C에서 AA 및 TAA 안정성. (A)24시간 동안 AA 및 TAA 피크영역(B)AA 및 TAA 함량(건조 중량의 mgg-1)을 24시간 동안. 막대는 5°C의 자동 샘플러에 보관되고 빛에 노출되지 않도록 보호된 두 개의 기술 복제(n=2)의 표준 편차를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 2: 최적화된 프로토콜과 TAA, AA 및 DHAA 추출 및 정량화에 대한 최적화되지 않은 프로토콜 간의 주요 차이점입니다. 사용된 샘플은 두 경우 모두 동일했습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

비타민 C는 매우 중요한 영양소이지만 매우 음순 화합물이므로 UPLC-UV 정량화는 샘플 저장 및 준비, 추출 방법 및 크로마토그래피 조건과 같은 여러 요인에 의존합니다. 따라서, DHAA에 AA (항산화 힘) 산화를 방지하기 위한 빠르고 간단한 절차가 필요하였다(항산화 특성 없이). 또한 화합물의 안정성을 촉진하기 위해 시료 처리 중 강렬한 빛과 산화 대기뿐만 아니라 높은 pH 및 온도 조건을 피하는 것이 중요했습니다.

AA 산화를 최소화하기 위해 다음과 같은 조치를 취했습니다. 우선, 샘플은 비타민 C 함량의 정확한 정량화를 보장하고 샘플을 쉽게 조작하기 위해 두 프로토콜모두에 대한 시작 재료로 lyophilized되었습니다. 이 옵션은 먼지가 매우 빠르게 해저되어 물을 다시 사용할 수 있게 됨에 따라 일반적으로^{문헌(19)을}통해 발견되는 미세 연삭보다 선호되었다. 추출 절차 동안, 더 높은 양의 산성 용액(8% 아세트산 및 1% MPA)은 최적화된프로토콜(보충 파일 2)에서추출제로 사용되었으며, 이는 또한 AA 분해를 방지하여 안정제 역할을 하였다. 이 솔루션은 또한 안정화를 증가시키는 첼리팅 에이전트로서 EDTA를 포함^16,비 최적화 프로토콜(보충 파일 2)에서추출제와는 달리. 더욱이, 우리는 5mL가 아닌 단일 추출물 2.5mL로 2회 연속 추출을 사용하고 표준 대기 조건이 아닌_N2 대기하에서 추출 절차를 강화할 수 있는지 테스트했습니다. 수정되지 않은 대기 하에서 하나의 추출만 사용하여 최상의 결과를 달성했으며, 불필요한 추가 단계(표시되지 않은 데이터)를 만들어 프로토콜을 단순화했습니다. 다른 사소한 변화는 또한 추출(즉, 초음파 처리)을 향상시키고, 더 명확한 추출물(미세한 여과)을 얻고 프로토콜 지속 시간을 감소시키기 위해 프로토콜에 도입되었다(보충파일 2). 크로마토그래피 조건에 관해서는, 방법의 유효성 검사는¹⁸전에 보고된 바와 같이 수행되었으며, 좋은 분석 파라미터(표3)를보장하였다. 게다가, 포름산(pH 2.0)과 메탄올(98:2 v)을 이용한 초순수수의 사용은 0.3mL~1유량을, 모노포타슘 인산염 30mMMMMMMM(pH 3.0)대신 이동상(보충파일2)으로1mL분-1로 하는 방식으로 개선된 방법. 가장 중요한 발전은 HPLC 대신 UPLC 시스템을 사용하여 영향을 미치는 조건 (온도 등)을 더 잘 제어 할 수 있었고 알 수없는 화합물에 의한 간섭없이 AA 피크를 해결하여 짧은 시간 동안 추출물의 양이 적었습니다(보충 파일 2).

그럼에도 불구하고이 방법에는 두 가지 주요 제한이 있습니다. 첫 번째는 스펙트럼의 UV 범위에서 낮은 흡수성으로 인해 DHAA가 UV 검출기를 사용하여 직접 측정할 수 없다는 것입니다. 특정 생물학적 활성을 제시하고 인체에서 AA로 쉽게 전환할 수 있기 때문에 DHAA 함량을 정량화하는 것이 중요하다^5. 이를 위해, TAA를 측정한 다음 TAA(그림3)로부터AA 함량을 빼서 DHAA를 간접적으로 결정하기 위해 두 번째 크로마토그래피 실행과 함께 DHAA를 AAA로 감소시키는 추가 반응이 필요하다. 이러한 의미에서, 환원 단계는 환원제(DTT)의 고농도를 이용하여 반응 시간을 5내지 30분으로 늘리고, 황산(보충파일 2)과의반응을 중지함으로써 최적화되었다. AA의 낮은 안정성은 방법의 두 번째 한계를 구성한다. AA는 추출 후 4h(추가파일 1)를저하시키기 시작하면 이 시간 간격으로 정량화할 필요가 있습니다. 따라서 추출할 샘플 수는 크로마토그래피 절차에 의해 조절됩니다. 그렇기 때문에 이 프로토콜의 해당 단계에서 동결을 제안하지만, 이 경우 모든 것을 UPLC 자동 샘플러에 자동으로 측정할 수 있는 것은 아닙니다. 다행히도, AA에 대한 감소 된 RT는 우리가 3 분 크로마토그램을 얻을 수 있게 해주었으며, HPLC(보충 파일 2)를사용하여 얻은 7 분 크로마토그램보다 훨씬 짧습니다. 따라서 비타민 C 함량은 4h 창에서 많은 수의 샘플에서 결정될 수 있습니다.

그림 3: 양상추와 일부 야생 친척에 비타민 C의 정량화의 워크플로우.
AA 또는 AA + DHAA(TAA)의 판정을 위해 두 가지를 보여주는 최적화된 프로토콜의 회로도도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

비타민 C는 인간에게 필수적인 영양소이며 중요한 건강 상의 이점 때문에 많은 연구의 대상이 되었습니다. 따라서, 그것은 양상추를 포함하여 작물의 큰 다양성에서 정량화되었습니다, 전 세계적으로 가장 소비 야채 중 하나. 간단한 고전 적 방법은 점차적으로 더 구체적이고 정확한¹⁰이기 때문에 액체 크로마토그래피 기술로 대체되었습니다. 그러나, HPLC를 통해 AA와 DHAA를 정량화하기 위한 추가 반응의 필요성으로 인해, 양상추에 대한 일부 연구에서는 AA¹⁴ 또는 TAA 11(DHAA를 AA로 감소시키기 전에 AA를 정량화하지 않고)만 측정하였다. 더욱이, 비타민 C 항산화 활성^2에두 분자의 기여에도 불구하고, 소수의 저자만이 AA와 DHAA를 정량화했다. 그럼에도 불구하고, UPLC 기술은 여러 작물에서 비타민 C를 측정 할 때 높은 성능 때문에 최근 몇 가지 에서 더 중요해지고있다^16. 이 연구에서 얻은 결과를 UPLC 및 HPLC의 두 가지 방법론과 비교하면 이러한 장점이 확인되었습니다: 높은 감도 덕분에 잘 정의된 AA 피크가 달성되었으며, 이는 또한 소비되는 자원이 적다는 것을 의미합니다. UPLC 효율에도 불구하고, 오직 첸 외^20만이 양상추의 비타민 C 함량을 측정하기 위해 이 기술을 적용했으며, 이는 여전히 AA 형태만 정량화되었기 때문에 과소평가로 이어졌습니다.

요약하자면, 이 작품은 다른 양상추 품종뿐만 아니라 야생 친척 중 일부에서 전체 비타민 C 함량을 결정하는 첫 번째 성공적인 시도를 나타냅니다. 비타민 C 정량화는 또한 번식 프로그램 내에서 더 높은 항산화 활성을 가진 양상추를 선택하는 데 필수적입니다. 이러한 의미에서, 상추 야생 친척의 총 비타민 C 함량이 증가하고, 이전 연구에서 보고된 AA^{함량증가(14)}및 기타 항산화^{화합물(21)은}양상추의 영양가를 향상시키기 에 적합한 후보를 확대한다.

결론적으로, 추출 후 몇 시간 후 점진적 저하 또는 낮은 DHAA UV-흡수성으로 인한 감소 반응의 필요성과 같은 비타민 C의 자연에 내재된 몇 가지 제한에도 불구하고, 비타민 C 함량을 측정하는 노동 강도가 적고 시간이 덜 소요되는 방법을 제공합니다. 또한 매우 견고하며 높은 감도와 해상도의 힘을 보여줍니다. 또한, 약간의 변화가 없는 다른 식물 재료뿐만 아니라 비타민 C의 식이 섭취를 인간에게 공급하는 가공 제품으로 쉽게 이전할 수 있어 신뢰할 수 있는 식품 품질을 위한 새로운 테스트 분야에서 다양한 미래 응용 분야를 제공합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 감사이 작업에 필요한 씨앗을 공급하기위한 사라고사의 야채 세균 은행 (BGHZ-CITA, 스페인)와 유전 자원 센터 (CNG, Wageningen, 네덜란드)를 인정합니다. CITA의 J. A. A. 아란주엘로, A. 카스텔라노스, “메타토리오 데 valoración nutritiva”에 대한 기술 지원, 그리고 D. L. Goodchild에게 영어 를 검토해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 프로젝트 RTA2017-00093-00-00에 의해 투자되었다 국립 농업 및 식품 연구 및 기술 연구소에서 (INIA) 및 아라곤 정부의 LMP164_18; 그리고 운영 프로그램 FEDER 아라곤 2014-2020 및 유럽 연합 (EU)의 유럽 사회 기금에 의해 [그루포스 콘솔리다도스 A12-17R: “그루포 드 investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica”와 A14-17R: “시스테마아 아가나데로스 알리멘타리오스 sostenibles”(SAGAS)]. I.M.L.은 스페인 과학, 혁신 대학 부 (MCIU)와 스페인 국가 연구 기관 (AEI)의 의사 교육을위한 사전 박사 전 계약에 의해 지원되었습니다.

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

References

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Cite This Article

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).