Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (<em>Lactuca sativa</em> L.) and Crop Wild Relatives (<em>Lactuca</em> spp.)

In&#233;s Medina-Lozano; Juan  Ram&#243;n Bertol&#237;n; Raquel Zufiaurre; Aurora D&#237;az

doi:10.3791/61440

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生物化学

Metodo UPLC-UV migliorato per la quantificazione della vitamina C nelle varietà di lattuga(Lactuca sativa L.) e nei parenti selvatici delle colture(Lactuca spp.)

Published: June 30, 2020

doi:

10.3791/61440

Inés Medina-Lozano*^1,4, Juan Ramón Bertolín*^2,4, Raquel Zufiaurre³, Aurora Díaz^1,4

¹Unidad de Hortofruticultura,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ²Unidad de Producción y Sanidad Animal,Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), ³Dpto Química Analítica,Escuela Politécnica Superior (Universidad de Zaragoza), ⁴Instituto Agroalimentario de Aragón – IA2 (CITA-Universidad de Zaragoza)

Summary

Presentiamo un metodo rapido e affidabile per quantificare la vitamina C in Lactuca spp. I passaggi chiave sono la preparazione del campione e l’estrazione della vitamina C in condizioni stabili, la riduzione dell’acido deidroascorbico in acido ascorbico e l’ottimizzazione della procedura cromatografica.

Abstract

Le vitamine, in particolare la vitamina C, sono importanti micronutrienti presenti in frutta e verdura. La vitamina C è anche uno dei principali contributori alla loro capacità antiossidante. La lattuga è una delle verdure più popolari tra i consumatori di tutto il mondo. Un protocollo accurato per misurare il contenuto di vitamina C nella lattuga e in altre specie correlate è fondamentale. Descriviamo qui un metodo utilizzando la tecnica uplc-UV (liquid chromatography-ultravioletto) ad altissime prestazioni, in cui sono state ottimizzate la preparazione del campione, l’estrazione di vitamine e le condizioni cromatografiche.

Sono stati raccolti campioni per rappresentare l’intera pianta, congelati a -80 °C e liofilizzati per prevenire l’ossidazione indesiderabile e facilitarne la manipolazione. L’estrazione della vitamina C è stata effettuata in mezzi acidi, che hanno anche contribuito alla sua stabilità. Poiché la vitamina C può essere presente in due diverse forme interconvertibili, l’acido ascorbico (AA) e l’acido deidroascorbico (DHAA), entrambi i composti devono essere misurati per una quantificazione accurata. Il DHAA è stato quantificato indirettamente dopo la sua riduzione ad AA perché L’AA mostra un’assorbibilità più elevata rispetto al DHAA nell’intervallo UV dello spettro. Dallo stesso estratto sono state effettuate due misurazioni, una prima e una dopo quella reazione di riduzione. Nel primo caso, stavamo quantificando il contenuto di AA, e nel secondo abbiamo quantificato la somma di AA e DHAA (TAA: acido ascorbico totale) sotto forma di AA. Quindi, la quantità di DHAA è stata ottenuta indirettamente sottraendo AA proveniente dalla prima misurazione dal TAA. Sono stati determinati da UPLC-UV, utilizzando uno standard AA commerciale per costruire una curva di calibrazione e ottimizzare la procedura cromatografica, per ottenere picchi AA che sono stati completamente risolti in breve tempo. Questo protocollo potrebbe essere facilmente estrapolato a qualsiasi altro materiale vegetale con lievi o nessuna modifica. La sua accuratezza ha rivelato differenze statisticamente significative altrimenti non percepite. Altri punti di forza e limitazioni sono discussi più approfonditamente nel manoscritto.

Introduction

La lattuga coltivata(Lactuca sativa L.) è una delle verdure a foglia più prodotte e consumate al mondo, con una produzione totale di circa 27,3 milioni di tonnellate nel 2018^1. La lattuga è percepita come sana dai consumatori. Le proprietà nutrizionali sono principalmente attribuite alla fonte di composti antiossidanti nella coltura, come la vitamina C, tra gli altri come polifenoli e vitamina E². La vitamina C è un micronutriente essenziale per l’uomo a differenza di molti altri vertebrati, in quanto non siamo in grado di produrlo a causa di mutazioni presenti nel gene che codifica per l’enzima dell’ultimo passo nella via biosintetica³. È necessario per un normale metabolismo cellulare e svolge anche un ruolo importante nelle risposte immunitarie principalmente a causa della sua attività^{antiossidante 3}^,⁴.

La vitamina C totale è composta da acido ascorbico (AA) e acido deidroascorbico (DHAA). L’AA è la forma biologicamente più attiva della vitamina, ma il DHAA (il suo prodotto di ossidazione) mostra anche attività biologica e può essere facilmente convertito in AA nel corpo umano⁵. Pertanto, quantificare entrambe le forme è importante per determinare il contenuto totale di vitamina C di qualsiasi coltura orticola, lattuga inclusa.

Un’ampia varietà di approcci basati su diverse tecniche analitiche sono stati utilizzati per misurare la vitamina C nelle verdure, come metodi enzimatici, spettrofotometrici e titrimetrici^6,⁷^,⁸. Sebbene questi metodi siano semplici, non sono chimicamente specifici per AA⁹. Di conseguenza, i metodi cromatografici sono preferiti, in particolare la tecnica ad alte prestazioni della cromatografia liquida-ultravioletta (HPLC-UV), a causa della loro maggiore^{precisione 10}. HPLC-UV è stato utilizzato per determinare la vitamina C in una grande varietà di colture, come broccoli, spinaci e lattuga^11,^12,¹³. Tuttavia, la quantificazione simultanea di AA e DHAA è complicata a causa della bassa assorbibilità del DHAA nell’intervallo UV dello spettro. In alternativa, il DHAA può essere determinato indirettamente utilizzando un agente riducente che converte il DHAA in AA, misurando l’acido ascorbico totale (TAA), e quindi calcolando la differenza tra TAA e AA. A causa della necessità di una reazione di riduzione, in alcuni studi, solo AA è stato quantificato¹⁴, il che potrebbe effettivamente rappresentare una sottovalutazione dell’attività della vitamina C. Tale reazione di riduzione aggiuntiva è necessaria anche per determinare indirettamente il DHAA anche quando viene utilizzato l’ultimo progresso nelle tecniche di cromatografia liquida, cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC). Questo passaggio beneficia anche dei vantaggi che UPLC mostra rispetto all’HPLC: maggiore efficienza e risoluzione, maggiore sensibilità, analisi del tempo più breve e minor consumo di^{solventi 15.} Di conseguenza, la tecnica UPLC-UV è stata utilizzata per quantificare la vitamina C in diverse colture¹⁶.

Inoltre, L’AA è una molecola molto labile; pertanto, è importante sviluppare un protocollo che ne prevenga la degradazione durante la conservazione della lattuga e l’analisi della vitamina C⁹. In questo contesto, il seguente protocollo offre una quantificazione rapida e migliorata del contenuto di vitamina C nella lattuga da parte di UPLC-UV, nonché una procedura di estrazione efficiente. Non solo le cultivar d’élite sono state incluse nel presente studio, ma anche le razze terrestri tradizionali e alcuni parenti selvatici a causa del loro potenziale interesse per l’allevamento delle colture, in particolare nel miglioramento del valore nutrizionale della lattuga.

Protocol

1. Preparazione del materiale vegetale Campionare almeno due foglie per pianta in tubi di polipropilene da 50 ml, una esterna (più vecchia) e una interna (più giovane) per rappresentare più accuratamente l’intera pianta. Raccogliere almeno tre repliche biologiche per ogni campione. Congelarli immediatamente usando azoto liquido e conservarli a -80 °C fino all’uso. Assicurarsi che l’azoto liquido non entra nei tubi; altrimenti potrebbero esplodere quando rimossi a causa dell’espansione del gas durante la vaporizzazione.ATTENZIONE: Guanti e uno scudo facciale sono necessari a causa dei potenziali pericoli associati all’uso di azoto liquido. Rimuovere i tappi dai tubi e posizionarli sui vassoi all’interno della camera di liofilizzatore del liofilizzatore (Tabella deimateriali)programmata come segue: -25 °C per 72 h, -10 °C per 10 h, 0 °C per 10 h e 20 °C per almeno 4 ore. Mantenere la temperatura del condensatore e la costante di vuoto durante il processo di liofilizzazione rispettivamente a -80,2 °C e 112 mTorr. Quando il materiale è completamente asciutto (tra 4 e 7 giorni a seconda della pianta e del grado di compattazione nel tubo), conservare rispettivamente a 4 °C, -20 °C o -80 °C per lo stoccaggio breve (da giorni a settimane), medio (mesi) o lungo (anni). Si raccomanda l’inclusione di sacchetti contenenti perline di gel di silice nei tubi contenenti campioni. Posizionare i campioni liofilizzati in tubi in polipropilene da 20 ml insieme a sfere di acciaio inossidabile di 10 mm di diametro e macinarli con un vortice multitubo utilizzando l’intensità e il tempo necessari per ottenere una polvere fine.NOTA: Durante l’intero processo, proteggere i campioni dall’esposizione alla luce diretta. 2. Reagente e preparazione della soluzione Preparare la soluzione di estrazione del solvente: 8% acido acetico (v/v), 1% MPA (acido meta-fosforico) (w/v), 1 mM EDTA (acido etilendiamminatetraacetico). Calcolare il volume totale di solvente necessario per elaborare l’intero insieme di campioni tenendo conto del fatto che verranno aggiunti 5 mL a ciascuno di essi. Per preparare 1 L della soluzione, aggiungere a un pallone: 30 g di MPA, 0,372 g di disidratazione EDTA, 80 ml di acido acetico e 500 ml di acqua ultrapura (scalare volumi e quantità di conseguenza). Sigillare la bocca del pallone con pellicola di plastica. Una volta sciolto con l’aiuto di un agitatore magnetico, utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 1 L, aggiungendo l’acqua ultrapura necessaria. Preparare il tampone di reazione di riduzione (0,5 M Tris (2-ammino-2-(idrossimetil)-1,3-propanodiolo) pH 9.0) e la soluzione riducente (40 mM DTT (1,4-ditiothreitol) con 0,5 M Tris pH 9.0). Calcolare il volume totale della soluzione riducente necessaria per elaborare l’intero insieme di campioni tenendo conto del fatto che verranno aggiunti 200 μL a ciascuno di essi. Per preparare 100 mL del tampone, aggiungere ad un bicchiere: 6.055 g di Tris e 90 mL di acqua ultrapura (scalare volumi e quantità di conseguenza). Sigillare la bocca del becher con pellicola di plastica. Una volta sciolto con l’aiuto di un agitatore magnetico, regolare la soluzione in pH 9.0 aggiungendo 2 M HCl e utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 mL, aggiungendo l’acqua ultrapura necessaria. Per preparare 100 mL della soluzione riducente, aggiungere ad un bicchiere: 0,629 g di DTT (purezza: 98%) e 90 mL del tampone (0,5 M Tris pH 9.0) precedentemente preparato (da 2.2.1 a 2.2.2). Ridimensionare i volumi e le quantità di conseguenza. Sigillare la bocca del becher con pellicola di plastica. Una volta sciolto con l’aiuto di un agitatore magnetico, utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 mL, aggiungendo il volume necessario di tampone 0,5 M Tris pH 9.0.NOTA: La soluzione riducente è molto instabile. Ecco perché si consiglia vivamente una soluzione appena fatta. Acido solforico (0,4 M H2SO4) Calcolare il volume totale di acido solforico di 0,4 M necessario per elaborare l’insieme dei campioni tenendo conto del fatto che a ciascuno di essi saranno aggiunti 200 μL. Per preparare 100 mL della soluzione, aggiungere ad un bicchiere: 80 mL di acqua ultrapura e poi 2,22 mL di H2SO4 (purezza: 96%, densità: 1,84 g mL-1). Utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 ml, aggiungendo l’acqua ultrapura necessaria.ATTENZIONE: L’acido solforico è molto corrosivo, quindi deve essere maneggiato con dispositivi di protezione e sotto il cofano. Inoltre, l’acido deve essere aggiunto all’acqua ultrapura, e non all’acqua all’acido, per ridurre i fumi ed evitare incidenti. Acido cloridrico (2 M HCl). Per preparare 100 mL di acido cloridrico 2 M, aggiungere ad un bicchiere: 80 mL di acqua ultrapura e poi 6,13 mL di HCl (purezza: 37%, densità: 1,19 g mL-1). Sigillare la bocca del becher con pellicola di plastica. Utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 ml, aggiungendo l’acqua ultrapura necessaria. Ridimensionare i volumi di conseguenza.ATTENZIONE: L’acido cloridrico è molto corrosivo, quindi deve essere maneggiato utilizzando dispositivi di protezione e sotto il cofano. Inoltre, l’acido deve essere aggiunto all’acqua ultrapura, e non all’acqua all’acido, per ridurre i fumi ed evitare incidenti. Standard AA (stock e diluizioni) Pesare esattamente 10 mg di standard AA (purezza: 99%) utilizzando un bilanciere di precisione e aggiungere 90 mL di fase mobile (pH d’acqua ultrapura 2.0 con acido formico). Una volta sciolto con l’aiuto di un agitatore magnetico, utilizzare un pallone volumetrico per misurare con precisione 100 mL, aggiungendo il volume necessario di acqua ultrapura pH 2.0 con acido formico.NOTA: Proteggere questa soluzione stock dall’esposizione alla luce. Preparare cinque diluizioni dal materiale della norma AA per ottenere una curva di taratura seguendo le istruzioni della tabella 1 e procedere con il passaggio 5.2. Standard [AA] (μg mL-1) Soluzione AA (100 μg mL-1)(μL) Fase mobile (μL)a 1 0.5 5 995 2 2.5 25 975 3 5 50 950 4 10 100 900 5 25 250 750 A Acqua ultrapura pH 2.0 acidificata dall’acido formico. Tabella 1: Protocollo per la preparazione di cinque norme di AA (acido ascorbico). Sono indicati volumi di soluto e solvente per preparare ciascuna delle diverse concentrazioni delle norme. 3. Estrazione di AA e DHAA NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni di bassa intensità luminosa durante le fasi di estrazione. Ad un tubo di centrifuga in polipropilene da 15 ml aggiungere 50 mg di campione macinato llyofilizzato e 5 ml del solvente da estrazione (fase 2.1). Agitare la miscela usando un vortice per 5 s e quindi uno shaker orbitale per 10 minuti a 2000 giri/min. Introdurre il tubo in un bagno ad ultrasuoni per 10 minuti a temperatura ambiente con ultrasuoni attivati. Centrifuga a 4.000 x g per 10 min a 4 °C. Prendi il supernatante, passalo attraverso un filtro di cellulosa rigenerata da 0,22 μm e conservalo in una fiala ambrata da 5 mL. Questo è l’estratto 1, che contiene AA e DHAA.NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui congelando gli estratti a -80 °C e proteggendoli dall’esposizione alla luce in quanto AA e DHAA sono molto instabili e si degradano facilmente in presenza di luce, ad alte temperature o in atmosfere ossidanti(File supplementare 1). 4. Riduzione del DHAA ad AA per l’estrazione del TAA Trasferire 200 μL di estratto 1 in una fiala ambrata da 2 mL per la cromatografia liquida e aggiungere 200 μL della soluzione riducente (fase 2.2). Chiudere il flaconcino con un tappo in PTFE-silicone con preapertura e scuoterlo con un vortice per 5 s. Lasciare riposare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente e proteggere dalla luce. Aggiungere 200 μL di 0,4 M H2SO4 per fermare la reazione e stabilizzare L’AA nel pH acido. La soluzione risultante è l’estratto 2, che contiene solo AA ed è in realtà TAA. 5. Determinazione Preparazione UPLC-UV Preparare le soluzioni di lavoro descritte nella tabella 2, opportunamente filtrate attraverso filtri da 0,22 μm, sonicate per almeno 10 minuti e posizionarle nel sistema UPLC. Accendere i tre moduli UPLC e attendere il termine del processo di calibrazione interno. Aprire il software (ad esempio Empower 3) e caricare il programma strumentale descritto nella tabella 2: Empower 3 | Esecuzione di esempi | Metodo della vitamina C | UPLC_PDA | Utilizzare guida introduttiva. Una volta caricato il software con il programma corretto, accedere alla console di gestione UPLC: Quaternary Solvent Manager | Fare clic con il pulsante destro del mouse | Console di avvio. Procedere alla preparazione e stabilizzazione dello strumento UPLC: Sistema | Proprietà Control | Avvio. Eliminare tutte le linee UPLC per almeno 5 min: Prime Solvents | | Controllare A, B, C, D e Lavaggio guarnizione | Durata di prime > 5 min. Spurgo e pulizia dell’iniettore: Solventi Primi | | Controllare il solvente wash (> 45 s) e controllare il solvente di spurgo (> 35 cicli). Equilibrare UPLC in base alle condizioni del metodo: Equilibrare al metodo | | Flusso (0,3 mL min-1) | Solvente A (2%) | Solvente B (0%) | Solvente C (98%) | Solvente D (0%); Equilibrate al metodo | | Campione (5 °C) | Colonna (30 °C) ed Equilibrato al metodo | | Controlla lampada attiva | Premere Start. Attendere almeno 1 h (si consiglia ancora più tempo) per stabilizzare l’apparecchiatura. La stabilità può essere verificata controllando la pressione nella colonna nella console di lancio: Sistema | Gestore dei solventi quaternari | Pressione del sistema QSM. Assicurarsi che non vi siano tendenze identificabili nelle variazioni di pressione (aumenti o diminuzioni) e che il valore delta sia inferiore a 10 psi. Nella schermata Guida introduttiva riempire la matrice con i nomi degli standard e degli esempi da analizzare. Determinazione AA negli standard Trasferire 1 mL di ciascuna delle cinque norme AA precedentemente preparate (fase 2.5.3) a flaconcini ambrati da 2 mL per la cromatografia liquida. Chiudere il flaconcino con un tappo in silicone PTFE con preapertura e iniettare 5 μL nello strumento UPLC. Effettuare la cromatografia seguendo la procedura descritta nella tabella 2 a partire dalla più diluita alla più concentrata. Determinazione AA nei campioni Pipetta 200 μL di Estratto 1 in una fiala ambrata da 2 mL per cromatografia liquida e aggiungere 800 μL di acqua ultrapura. Chiudere il flaconcino con un tappo in silicone PTFE con preapertura e iniettare 5 μL nello strumento UPLC. Effettuare la cromatografia secondo la procedura descritta nella tabella 2. Determinazione del TAA nei campioni Aggiungere 400 μL di acqua ultrapura all’estratto 2. Chiudere il flaconcino con un tappo in silicone PTFE con preapertura e iniettare 5 μL nello strumento UPLC. Effettuare la cromatografia secondo la procedura descritta nella tabella 2. Componenti e parametri Descrizione Strumento Acquity UPLC Classe H Rivelatore Rilevatore PDA eλ λabs per AA=245 nm Software Empower 3 Colonna Acquity UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm x 1,8 μm) Canale A CH3OH Canale B/Lavaggio H2O:CH3OH (50:50 v:v) Canale C Acqua ultrapura pH 2.0 acidificata dall’acido formicoa Canale D/Lavaggio guarnizione Acqua ultrapura:acetonitrile (90:10 v:v) Fase mobile 0,3 mL min-1 di 2%A + 98%C (modalità isocratica) Temperatura colonna 30 °C Temperatura autocampionatore 5 °C Volume di iniezione 5 μL Tempo di conservazione AA 1.874 min Tempo di esecuzione 3 min A Volume indeterminato di acido formico utilizzato fino alla regolazione del pH Tabella 2: Procedura cromatografica ottimizzata per determinare l’AA (acido ascorbico) negli estratti di lattuga e parenti selvatici. Descrizione dei componenti, delle condizioni e delle soluzioni impiegate. 6. Quantificazione di AA e DHAA Analisi statistica Determinare i parametri analitici del metodo cromatografico descritti da Bertolín etal. NOTA: I valori dei parametri presentati nella tabella 3 dovranno essere definiti in condizioni sperimentali specifiche. Parametri analitici del metodo Valori Intervallo lineare (μg mL-1) 0.5-25 Equazione lineare y=53.143,03x R2 0.99998 Limiti di rivelazione (mg AA g-1 di sostanza secca) 0.013 Limiti di quantificazione (mg AA g-1 di sostanza secca) 0.045 Ripetibilità (CV, %)a 1.75 Precisione intermedia (CV,%) 4.22 Recupero (Reg, %)b 95.6±2.4 A CV: coefficiente di variazione b Il saggio di recupero è stato eseguito con 10 aliquote contenenti 50 mg dello stesso campione, 5 chiodate con 2 mg di AA g-1 di sostanza secca e 5 non chiodate. %Rec=([AA]campione con picco-[AA]sample)/([AA]spiked)x100. Tabella 3: Parametri analitici ottimizzati per l’individuazione e la quantificazione di AA (acido ascorbico) e TAA (acido ascorbico totale). L’intervallo lineare, l’equazione e il coefficiente di determinazione della curva di taratura (R2),nonché i limiti di rivelazione e quantificazione di AA (lo stesso per TAA), e la ripetibilità, la precisione intermedia e il recupero sono stati ottenuti con un volume di iniezione del campione di 5 μL. Calcolare la concentrazione di AA e TAA. Aprire i cromatogrammi standard ed esempio: Guida introduttiva | Proprietà Browse Project | I canali | “nome dello standard o del campione” | PDA Ch1 245 nm@1,2 nm. Integrare il picco corrispondente (AA o TAA) negli standard e nei campioni cliccando sul suo punto di partenza (circa 1.790 min) e trascinandolo con il mouse fino al punto finale (circa 1.910 min). Costruire una curva di taratura che rappresenti i valori di assorbanza determinati cromatograficamente (fase 5.2.) rispetto alla concentrazione delle cinque norme AA sopra preparate(tabella 1). Interpolare i valori di assorbanza dei campioni determinati nei passaggi 5.3 e 5.4 e ottenere rispettivamente la concentrazione di AA e TAA con la seguente formula:dove y è l’area di picco integrata, x è la concentrazione AA o TAA in ppm e m e n sono rispettivamente la pendenza e l’intercetta ydella linea di regressione ottenuta. Per calcolare la concentrazione di DHAA, applicare la seguente formula:NOTA: Per ottenere le concentrazioni totali di DHAA, AA e TAA in mg g-1 di peso secco, i valori ottenuti interpolando direttamente nella curva di taratura dovranno essere moltiplicati per il volume totale dell’estratto e il fattore di diluizione applicato, e quindi divisi per il peso del campione utilizzato per effettuare l’estrazione.

Representative Results

La quantificazione della vitamina C nelle matrici di Lactuca richiede lo sviluppo di un approccio cromatografico in grado di garantire risultati affidabili. La figura 1A mostra un cromatogramma risultante da un protocollo non ottimizzato (File supplementare 2), che presenta un picco AA insieme a una “spalla” minore non identificata. Tuttavia, dopo aver migliorato le condizioni di estrazione e cromatografiche, è stato raggiunto un picco AA risolto senza interferenze di composti sconosciuti (Figura 1B). Inoltre, l’utilizzo di apparecchiature UPLC-UV al posto di HPLC-UV ci ha permesso di ridurre il tempo di ritenzione (RT) per AA: 1.874 min nei cromatogrammi ottimizzati rispetto a 2.980 min in quelli non ottimizzati(Figura 1),nonché i tempi di esecuzione, rispettivamente 3 e 7 minuti per i protocolli ottimizzati e non ottimizzati. Figura 1: Cromatogrammi di AA nello stesso campione di lattuga (cultivar commerciale «Begoña»). (A) Cromatogramma HPLC-UV risultante da un protocollo non ottimizzato (condizioni descritte nel file supplementare 2). (B) Cromatogramma UPLC-UV ottenuto con il protocollo ottimizzato (condizioni descritte nella tabella 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Le interferenze nei picchi AA, come quelle osservate nella figura 1A, hanno costantemente portato a una sottovalutazione del contenuto di vitamina C (AA, DHAA e TAA)(figura 2)a causa di una separazione insufficiente durante il processo cromatografico in quanto le aree di picco sovrapposte sono state integrate da una caduta verticale nel punto più profondo tra di esse. Questa distorsione è particolarmente evidente nel caso dei parenti selvatici delle colture, in particolare nel contenuto di DHAA e TAA(figura 2). Figura 2: Distribuzione del contenuto di vitamina C. Trame per violino diviso di contenuto di DHAA, AA e TAA (mg g-1 di peso secco) in varietà di lattuga commerciali e tradizionali e alcuni parenti selvatici utilizzando protocolli non ottimizzati e ottimizzati. Le linee nere mostrano i valori medi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Inoltre, l’uso di un protocollo non ottimizzato ci ha impedito di estrarre qualsiasi conclusione utile dai risultati in quanto mostravano tutti i campioni, sia tipi di lattughe che parenti selvatici, con un contenuto di vitamina C simile. Al contrario, il protocollo ottimizzato ci ha permesso di rilevare differenze statisticamente significative tra loro per il contenuto di DHAA e TAA(tabella 4),le più ricche sono le specie selvatiche (Figura 2). Non ottimizzato Ottimizzato Rapporto F p-valore Rapporto F p-valore DHAA 0.460 0,637ns 5.613 0.009** Aa 0.070 0,932ns 1.020 0,374ns Taa 0.015 0,985ns 4.438 0.022* ns, * e ** indicano non significativi e significativi rispettivamente a p<0,05 e 0,01. Tabella 4: Variazione del contenuto di vitamina C. Rapporti F (quozienti di due varianze, la varianza tra gruppi e la varianza all’interno del gruppo) e valori significativi dall’ANOVA unidirezionali considerando il tipo di Lactuca (varietà di lattuga commerciale, varietà di lattuga tradizionali e parenti selvatici delle colture) per il contenuto di DHAA, AA e TAA in protocolli non ottimizzati e ottimizzati. File supplementare 1: stabilità AA e TAA a 5 °C su 24 h. (A) Zone di picco AA e TAA in 24 h. (B) Contenuto di AA e TAA (mg g-1 di peso secco) in 24 ore. Le barre rappresentano le deviazioni standard di due repliche tecniche (n=2) conservate nell’autocampionatore a 5 °C e protette dall’esposizione alla luce. Clicca qui per scaricare questo file. File supplementare 2: Principali differenze tra il protocollo ottimizzato e il protocollo non ottimizzato per l’estrazione e la quantificazione TAA, AA e DHAA. I campioni utilizzati erano gli stessi in entrambi i casi. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La vitamina C è un nutriente molto importante, ma è anche un composto molto labile, quindi la sua quantificazione UPLC-UV dipende da molteplici fattori, come la conservazione e la preparazione del campione, il metodo di estrazione e le condizioni cromatografiche. Pertanto, era necessaria una procedura rapida e semplice per prevenire l’ossidazione dell’AA (con potere antiossidante) al DHAA (senza proprietà antiossidanti). Era anche fondamentale evitare condizioni di pH e temperatura elevate, nonché luce intensa e un’atmosfera ossidante durante il trattamento del campione per promuovere la stabilità del composto.

Per ridurre al minimo l’ossidazione dell’AA, sono state adottate le seguenti misure. Prima di tutto, i campioni sono stati liofilizzati come materiale di partenza per entrambi i protocolli per garantire un’accurata quantificazione del contenuto di vitamina C e manipolare facilmente i campioni. Questa opzione è stata preferita rispetto alla rettifica fine, comunemente trovata in tutta la^{letteratura 19}, poiché la polvere si scongela molto rapidamente in modo che l’acqua diventi nuovamente disponibile. Durante la procedura di estrazione, un volume maggiore di una soluzione più acida (8% acido acetico e 1% MPA) è stato utilizzato come estrattore nel protocollo ottimizzato (File supplementare 2), che ha anche agito come stabilizzatore prevenendo la degradazione AA. Questa soluzione conteneva anche EDTA come agente chelating per aumentare la^{stabilizzazione 16}, a differenza dell’estrattore nel protocollo non ottimizzato (File supplementare 2). Inoltre, abbiamo testato se la procedura di estrazione potesse essere migliorata utilizzando due estrazioni consecutive con 2,5 mL di estrattore invece di una singola con 5 mL e sotto_{un’atmosfera} N 2 invece delle condizioni atmosferiche standard. I migliori risultati sono stati raggiunti utilizzando una sola estrazione in un’atmosfera non modificata, che ha semplificato il protocollo effettuando passaggi aggiuntivi non necessari (dati non mostrati). Altre modifiche minori sono state introdotte nel protocollo al fine di migliorare l’estrazione (cioè la sonicazione), ottenere un estratto più chiaro (filtrazione più fine) e ridurre la durata del protocollo(File supplementare 2). Per quanto riguarda le condizioni cromatografiche, la convalida del metodo è stata effettuata come riportato^{prima delle 18,}garantendo buoni parametri analitici(tabella 3). Inoltre, l’uso di acqua ultrapura con acido formico (pH 2.0) e metanolo (98:2 v:v) con un flusso di 0,3 mL min^-1, invece di fosfato monopotassio 30 mM (pH 3.0) a 1 mL min^-1 come fase mobile(File supplementare 2),ha portato a un metodo migliorato. Il progresso più importante è stato probabilmente l’utilizzo di un sistema UPLC al posto di un HPLC, che ci ha permesso un maggiore controllo delle condizioni di impatto (come la temperatura) e con conseguente risoluzione dei picchi AA senza interferenze da parte di composti sconosciuti, in un tempo più breve e consumando meno volume di estratto(File supplementare 2).

Tuttavia, ci sono due limitazioni principali di questo metodo. Il primo è che il DHAA non può essere misurato direttamente utilizzando un rivelatore UV a causa della sua bassa assorbibilità nell’intervallo UV dello spettro. È importante quantificare il contenuto di DHAA perché presenta una certa attività biologica ed è facilmente convertibile in AA nel corpo umano⁵. A tal fine, è necessaria una reazione aggiuntiva per ridurre il DHAA all’AA, insieme a una seconda esecuzione cromatografica al fine di misurare il TAA e quindi determinare indirettamente il DHAA sottraendo contenuto AA da TAA (Figura 3). In questo senso, il passaggio di riduzione è stato ottimizzato utilizzando una maggiore concentrazione dell’agente riducente (DTT), aumentando il tempo di reazione da 5 a 30 minuti e fermando la reazione con acido solforico(File supplementare 2). La bassa stabilità di AA costituisce la seconda limitazione del metodo. Quando AA inizia a degradarsi 4 ore dopo l’estrazione (File supplementare 1), è necessario quantificarlo in questo intervallo di tempo. Quindi, il numero di campioni da estrarre è condizionato dalla procedura cromatografica. Ecco perché proponiamo di congelarli in quella fase di questo protocollo, anche se in tal caso non tutti potrebbero essere inseriti nell’autocampionatore UPLC per essere misurati automaticamente. Fortunatamente, l’RT ridotto per AA ci ha permesso di ottenere cromatogrammi da 3 minuti, molto più brevi dei cromatogrammi da 7 minuti ottenuti utilizzando HPLC(File supplementare 2). Pertanto, il contenuto di vitamina C potrebbe essere determinato in un numero elevato di campioni in una finestra di 4 ore.

Figura 3: Flusso di lavoro della quantificazione della vitamina C nella lattuga e di alcuni parenti selvatici.
Diagramma schematico del protocollo ottimizzato che mostra due rami per la determinazione solo di AA o AA + DHAA (TAA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Poiché la vitamina C è un nutriente essenziale per l’uomo e a causa dei suoi importanti benefici per la salute, è diventata oggetto di molti studi. Pertanto, è stato quantificato in una grande varietà di colture, tra cui la lattuga, una delle verdure più consumate in tutto il mondo. Semplici metodi classici sono stati gradualmente sostituiti da tecniche di cromatografia liquida perché sono più specifici e accurati¹⁰. Tuttavia, a causa della necessità di una reazione aggiuntiva per quantificare entrambi, AA e DHAA tramite HPLC, in alcuni studi sulla lattuga, sono stati misurati solo AA¹⁴ o solo TAA¹¹ (senza quantificare AA prima della riduzione del DHAA in AA). Inoltre, solo pochi autori hanno quantificato AA e DHAA, nonostante il contributo di entrambe le molecole all’attività antiossidante della vitamina C². Tuttavia, la tecnica UPLC è diventata più importante negli ultimi tempi a causa delle sue prestazioni più elevate quando misura la vitamina C in diverse^{colture 16}. Confrontando i risultati ottenuti in questo studio con le due metodologie, UPLC e HPLC, questi vantaggi sono stati confermati: sono stati raggiunti picchi AA ben definiti grazie a una maggiore sensibilità, e in tempi molto brevi, che implica anche meno risorse consumate. Nonostante l’efficienza dell’UPLC, solo Chen et^al.

In sintesi, questo lavoro rappresenta il primo tentativo riuscito di determinare il contenuto totale di vitamina C non solo in diverse varietà di lattuga, ma anche in alcuni dei loro parenti selvatici. La quantificazione della vitamina C è anche essenziale per selezionare lattughe con una maggiore attività antiossidante all’interno dei programmi di allevamento. In questo senso, l’aumento del contenuto totale di vitamina C nei parenti selvatici di lattuga trovato qui e l’aumento del contenuto di AA riportato negli studi^{precedenti 14}, così come altri composti^{antiossidanti 21}, amplia i candidati adatti per migliorare il valore nutrizionale delle lattughe.

In conclusione, anche con alcune limitazioni inerenti alla natura della vitamina C, come la sua graduale degradazione poche ore dopo l’estrazione o la necessità di una reazione di riduzione dovuta alla bassa assorbibilità UV DHAA, offre un metodo meno laborioso e meno dispendioso in termini di tempo per misurare il contenuto di vitamina C. Inoltre, è anche molto robusto e mostra un’alta sensibilità e potenza di risoluzione. Inoltre, è facilmente trasferibile non solo ad altri materiali vegetali con lievi o nessuna modifica, ma anche a prodotti trasformati che forniscono l’assunzione alimentare di vitamina C all’uomo, il che dà origine a una vasta gamma di applicazioni future nel campo emergente dei test per una qualità alimentare affidabile.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo con gratitudine la Vegetable Germplasm Bank di Saragozza (BGHZ-CITA, Spagna) e il Centre for Genetic Resources (CNG, Wageningen, Paesi Bassi) per aver fornito le sementi necessarie per questo lavoro. Ringraziamo J. A. Aranjuelo, A. Castellanos e “laboratorio de valoración nutritiva” del CITA per il supporto tecnico e D. L. Goodchild per aver esaminato la lingua inglese. Questo lavoro è stato finanziato dai progetti RTA2017-00093-00-00 dell’Istituto Nazionale per la Ricerca e la Tecnologia Agricola e Alimentare (INIA) e LMP164_18 dal Governo dell’Aragona; e dal Programma Operativo FEDER Aragona 2014-2020 e dal Fondo Sociale Europeo dell’Unione Europea [Grupos Consolidados A12-17R: “Grupo de investigación en fruticultura: caracterización, adaptación y mejora genéica” e A14-17R: “Sistemas agroganaderos alimentarios sostenibles” (SAGAS)]. I.M.L. è stato sostenuto da un contratto pre-dottorato per la formazione dei medici del Ministero spagnolo della scienza, dell’innovazione e delle università (MCIU) e dell’Agenzia statale spagnola per la ricerca (AEI).

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) ≥98% (Ellman′s reagent)	Roche	10197777001
10 mm f stainless steel ball	Euro Aznar Supplies S.L.	20112100
15 mL polypropylene tube for centrifuge	DeltaLab	429946
2 mL HPLC amber vial	Agilent	5190-9063
2 mL syringe with needle	DeltaLab	JS2
20 mL polypropylene tubes	Dealtalab	202840
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIS) ≥99.9% (titration)	Roche	10708976001
50 mL polypropylene tube	DeltaLab	429951
Acetic acid (CH3COOH) ≥99% purity glacial, ReagentPlus	Sigma-Aldrich	A6283
Acetonitrilo, HPLC super gradient grade (99.9+% CH3CN-0.2 µm filtrated)	Chem-lab	CL00.0189
Acquity UPLC HSS T3 column (150 mm x 2.1 mm x 1.8 µm)	Waters	186003540
Beaker 1 L, 200 mL	DeltaLab	191725, 191722
Dipotassium phosphate (KH₂PO₄)	Panreac	766384	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium salt (EDTA x 2H2O) 99-101% assay, ACS reagent	Panreac	131669
Fisherbrand Analog MultiTube Vortexer	Thermo Fisher Scientific	15549004
Formic acid 98-100% for HPLC LiChropur	Supelco	5438040100
Freeze dryer VirTis genesis 25EL	VirTis	na
Heidolph Multi Reax mixer	Heidolph	na
Heidolph Reax top mixer	Heidolph	na
Hewlett Packard HPLC 1050 equipped with an eλ Detector	Hewlett Packard	na	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Hydrochloric acid (HCl) 37% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	320331
L-Ascorbic acid ≥99%, ACS reagent	Sigma-Aldrich	255564
Meta-phosphoric acid (MPA) ACS reagent, chips, 33.5-36.5%	Sigma-Aldrich	239275
Methanol ≥99.9% (HPLC supergradient grade)	ChemLab	CL00.0189.2500
Micropipettes 10-1000 μL	Socorex	na
Nucleosil 120 C18 Tracer column (250 mm x 4 mm x 5 µm)	Merck (Sigma-Aldrich)	54919	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
PTFE-silicone cap with preaperture	Agilent	5190-9067
Refrigerated centrifuge Gyrozen 1248R	Gyrozen	na
Regenerated cellulose filters 0.22 µm (13 mm)	Agilent	1015190-5108
Regenerated cellulose filters 0.45-µm (13 mm)	Labbox	SFCA-145-100	Only in the non-optimized protocol (Supplemental File 2)
Spectrophotometer Heλios β	Thermo Scientific Corporation	na
Sulfuric acid (H₂SO₄) 95.0-98.0% purity, ACS reagent	Sigma-Aldrich	258105
Ultrapure water	WasserLab	na
Ultrasons H-D	Selecta	na
Volumetric flasks 1 L, 100 mL	DeltaLab	191489, 191486
Waters Acquity UPLC H-Class equipped with a PDA eλ Detector	Waters	na

References

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Cite This Article

Medina-Lozano, I., Bertolín, J. R., Zufiaurre, R., Díaz, A. Improved UPLC-UV Method for the Quantification of Vitamin C in Lettuce Varieties (Lactuca sativa L.) and Crop Wild Relatives (Lactuca spp.). J. Vis. Exp. (160), e61440, doi:10.3791/61440 (2020).