Моделирование инфекции вируса гепатита В в клетках не хедпатического 293T-NE-3NRs
Summary
Эта рукопись описывает подробный протокол для инфекции вируса гепатита В (HBV) в новых 293T клеток (293T-NE-3NRs, выражая человека NTCP, HNF4, RXR и PPAR) и традиционных печенок клеток (HepG2-NE, выражая человека NTCP).
Abstract
HBV главным образом заражает людские гепатоциты, но было также найдено, что заражает extrahepatic ткани such as почки и яички. Тем не менее, клеточные модели HBV ограничиваются гепатомными клеточными линиями (такими как HepG2 и Huh7) переэкспрессией функционального рецептора HBV, таурохолата натрия, коатрипрационного полипептида (NTCP). Здесь мы использовали 293T-NE-3NRs (293T overexpressing человека NTCP, HNF4, RXR и PPAR) и HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) в качестве модельных клеточных линий. HBV инфекция в этих клеточных линий была выполнена либо с использованием концентрированных частиц вируса HBV от HepG2.2.15 или совместного культивирования HepG2.2.15 с целевыми клеточными линиями. HBcAg иммунофлуоресценции для HBcAg была выполнена для подтверждения инфекции HBV. Два метода, представленные здесь, помогут нам изучить инфекцию HBV в неепатических клеточных линиях.
Introduction
Гепатит В влияет на жизнь более 2 миллиардов человек и является одной из основных угроз общественному здравоохранению. Приблизительно 257 миллионов человек хронически инфицированы вирусом гепатита В (HBV) во всем мире, вызывая большое бремя для общества1. Гепатоциты не единственные клетки, инфицированные HBV и другие клетки в неепатической ткани, такие как почки и яички, также инфицированы этим вирусом2,3. В настоящее время модели клеток инфекции HBV ограничены человеческими гепатоцитами только с несколькими моделями линии неепатических клеток. Это препятствует изучению инфекции HBV и HBV связанных патологии негепатических тканей. Здесь мы представляем протоколы для изучения инфекции HBV в не-печеночной клетки 293T, а также в гепатоме основе клеток.
Таурохолат натрия является функциональным рецептором вируса гепатита В и гепатита D4. Гепатоцитов ядерного фактора 4 “(HNF4”), ретиноид X рецептора (RXR) и пероксисомы пролифератор активированный рецептор (PPAR) являются печени обогащенных транскрипции факторов, ограничивающих вирусный тропизм HBV. Они были проверены для содействия HBV прегеномного синтеза РНК и поддержки репликации HBV в негепатомной клеточной линии5. Мы построили три различных клеточных линий, Хепг2 клеточных линий, выражающих NTCP (HepG2-NE), 293T линии клеток, выражающих NTCP (293T-NE) и 293T клеточной линии, выражающей четыре гена хозяина; NTCP, HNF4, RXR и ПТАРЗ (293T-NE-3NRs). Два метода для инфекции HBV были разработаны на основе 293T-NE-3NRs(рисунок 1). Первый метод использует прививку в 293T-NE-3NRs с высокой эквивалентностью вирусного генома (высокий GEq (150), DMSO и PEG8000) на 24 ч. Второй метод использует совместное культивирование 293T-NE-3NRs с HepG2.2.15, который может производить частицы HBV (низкий GEq (около 1.83) без DMSO и PEG8000), таким образом близко эмуируя естественные условия.
Клетки HepG2.2.15 получены из линии HepG2 и хронически выделяют инфекционные HBV, а также субвирусные частицы в культурную среду6,7. Циклоспорин А (CsA) является иммунодепрессантом, клинически используемым для подавления отторжения ксенотрансплантата. Исследования показали, что CsA ингибирует вход HBV в культивируемые гепатоциты, ингибируя транспортерную активность NTCP и блокируя привязку NTCP к большим белкамконверта 8.
Клетки HepG2-NE использовались в качестве положительного контроля, в то время как обработанные клетки CsA использовались в качестве отрицательного контроля. Сравнивая с положительными и отрицательными группами контроля, мы можем выяснить, какие гены хозяина играют важную роль в инфекции HBV. Кроме того, через этот режим инфекции HBV, мы также можем найти другие новые механизмы или принимающих генов, участвующих в инфекции HBV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы вводим протоколы для инфекции HBV в негепатических 293T-NE-3NRs и гепатома основе HepG2-NE клеток. 293T-NE-3NRs были пригодны для инфекции HBV как на высоком, так и на низком уровне GEq. При использовании нашего протокола необходимо принять во внимание следующие важные шаги. Состояние клеток являе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81870432 и 81570567 к X.L.З.), (No 81571994 к P.N.S.), Научно-исследовательский фонд для международных молодых ученых (No 81950410640 к W.I.); Фонд Университета Ли Ка Шин Шанту (Нет. L1111 2008 до P.N.S.). Мы хотели бы поблагодарить профессора Стэнли Лина из Медицинского колледжа Шанту за полезные советы.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
