Un modello di coltura cellulare per la produzione di titoli di epatite ad alto tire e virus

L’epatite E è una malattia abbastanza sottovalutata con una crescente prevalenza in tutto il mondo. Circa 20 milioni di infezioni provocano più di 70.000 decessi all’anno¹. L’agente sottostante, il virus dell’epatite E (HEV), è stato riassegnato di recente ed è ora classificato all’interno della famiglia Hepeviridae tra cui i generi Orthohepevirus e Piscihepevirus. HEV di varie origini sono classificati all’interno della specie Orthohepevirus A-D compresi isolati da esseri umani, suini, conigli, ratti, uccelli e altri mammiferi². Attualmente, sono stati identificati otto diversi genotipi (GT) del virus dell’RNA a singolo filamento positivo e a filamento^{singolo 2}. Sebbene differiscano nella loro identità di sequenza, nelle vie di trasmissione e nella distribuzione geografica, la loro struttura genomica è altamente conservata. Più specifico, il genoma HEV da 7,2 kbp è diviso in 3 grandi frame di lettura aperti (ORF1-3). Mentre ORF1 codifica tutti gli enzimi necessari per una replicazione di successo all’interno della cellula ospite, ORF2 codifica la proteina capside, e la proteina ORF3 opera come un canale ionico funzionale necessario per l’assemblaggio e il rilascio di particelle infettive³. Una volta rilasciato nel lume basale o apicale HEV esiste in entrambe, quasiavvolto e non-avvolto/nudo specie a seconda se il virus proviene da sangue o feci, rispettivamente^4,5.

Mentre GT1 e GT2 si trovano principalmente nei paesi in via di sviluppo che infettano esclusivamente gli^,esseri umani⁶ attraverso la via fecale-orale, GT3, GT4 e GT7 si verificano prevalentemente nei paesi sviluppati^1,7 con una varietà di specie che servono come serbatoi, ad esempio, suini⁸, ratto⁹, pollo^10,11, cervo¹², mangusta¹³, pipistrello¹⁴, coniglio^15,16, cinghiale¹⁷ e molti altri^7,18,19, fornendo prove di zoonosi^7,20,21. Oltre a condizioni sanitarie inadeguate²³ e prodotti alimentari contaminati^12,24,25,26, trasmissione tramite trasfusione di sangue e trapianti di organi è possibile anche^27,28. HEV è una causa comune di cirrosi epatica e insufficienza epatica²⁹ soprattutto nei pazienti con malattia epatica preesistente, individui immunocompromessi (genotipo 3, 4 e 7) e donne incinte (genotipo 1). Da notare, ci sono anche manifestazioni extraepatiche come la malattia ematopoietica^30,31,32, disturbi neurologici³³ e lesioni renali³⁴.

Ad oggi, il farmaco off-label ribavirin (RBV) è il trattamento di scelta per molti pazienti infetti^35,36. Tuttavia, sono stati segnalati casi di fallimento del trattamento e scarsi esiti clinici a lungo termine. Il fallimento del trattamento è stato collegato alla mutagenesi virale e all’aumento dell’eterogeneità virale nei pazienti cronicamente infetti^37,38,39. Al contrario, un recente studio multicentrico retrospettivo europeo non è stato in grado di correlare le mutazioni della polimerasi al fallimento del trattamento RBV⁴⁰. Nelle osservazioni cliniche e negli esperimenti in vitro, l’interferone^41,42,43, il sofosbuvir^44,45, i sali di zinco⁴⁶ e la silvestrol^47,48 hanno anche mostrato effetti antivirali. Ciò nonostante, rimane un trattamento specifico HEV, ostacolato dalla mancanza di conoscenza circa il ciclo di vita HEV e la sua patogenesi. Pertanto, è urgentemente necessario un solido sistema di coltura cellulare per gli studi virologici e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali⁴⁹.

Sfortunatamente, come altri virus dell’epatite, HEV è difficile da propagare nelle linee cellulari convenzionali e di solito progredisce molto lentamente portando a bassi carichi virali. Tuttavia, alcuni gruppi sono stati in grado di aumentare i carichi virali con la generazione di subcloni linea cellulare⁵⁰ o la regolazione dei supplementi multimediali⁵¹. Recentemente la generazione di cloni cDNA⁵² e l’adattamento del paziente primario isola passando^53,54 ulteriormente migliorato la propagazione HEV nella coltura cellulare⁵⁵. In questo protocollo, abbiamo usato il genoma di una coltura cellulare adattata ceppo Dikernow-C1 (noto come p6_WT)⁵⁴ e un ceppo mutante che ospita una mutazione che migliora la replicazione (indicata come p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 è il ceppo più usato nella coltura cellulare HEV ed è in grado di produrre carichi virali elevati. Valutando i numeri di copia dell’RNA virale, la replicazione HEV può essere monitorata in vitro. Tuttavia, queste tecniche non consentono la valutazione del numero di particelle infettive prodotte. Pertanto, abbiamo stabilito una colorazione immunofluorescenza per determinare le unità di formatura a fuoco (FFU/mL).

Il metodo qui descritto⁵⁶ può essere utilizzato per produrre particelle virali infettive a tutta lunghezza che sono in grado di infettare una varietà di tipi di cellule provenienti da diverse origini, tra cui cellule primarie e linee cellulari di mammiferi. Questo è un prerequisito fondamentale per decifrare aspetti importanti dell’infezione e del tropismo HEV. Non è necessario l’inoculazione con isolati di pazienti solitamente limitati. La produzione di particelle HEV infettive da plasmidi pone una fonte infinita, il che rende questo protocollo relativamente efficiente. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per la genetica inversa che consente lo studio dell’alterazione del genoma identificato in vivo e il loro impatto sulla replicazione e la forma fisica dell’HEV. Questa tecnica supera molti limiti e, può tracciare la strada per lo sviluppo di farmaci, gli studi di mutagenesi e la valutazione delle interazioni virus-ospite come fattori di restrizione o di ingresso.