En cell kultur modell för att producera hög titer hepatit E-virus lager

Hepatit E är en ganska underskattad sjukdom med ökande prevalens över hela världen. Omkring 20 miljoner infektioner resulterar i mer än 70.000 dödsfall per år¹. Det underliggande medlet, hepatit E-virus (HEV), omplacerades nyligen och klassificeras nu inom familjen Hepeviridae inklusive släktena Orthohepevirus och Piscihepevirus. HEV av olika ursprung klassificeras inom arten Orthohepevirus A-D inklusive isolat från människor, svin, kaniner, råttor, fåglar och andra däggdjur². För närvarande har åtta olika genotyper (GT) av det positiva, enkelsträngade RNA-viruset identifierats². Även om de skiljer sig åt i sin sekvensidentitet, överföringsvägar och geografisk fördelning, är deras genomiska struktur mycket bevarad. Mer specifikt är 7,2 kbp HEV-genomet indelat i 3 stora öppna läsramar (ORF1-3). Medan ORF1 kodar alla enzymer som behövs för en lyckad replikering i värdcellen kodar ORF2 capsidproteinet och ORF3-proteinet fungerar som en funktionell jonkanal som krävs för montering och frisättning av infektiösa partiklar³. När de släpps ut i den basala eller apikala lumen HEV finns i båda, quasienveloped och icke-höljeförsedd / naken art beroende på om viruset kommer från blod eller avföring,^{respektive 4,5}.

Medan GT1 och GT2 huvudsakligen finns i utvecklingsländer som enbart infekterar människor⁶ via fekal-oral väg, GT3, GT4 och GT7 förekommer främst i utvecklade länder^1,7 med en mängd olika arter som fungerar som reservoarer, t.ex., svin^8,råtta^9,kyckling^10,,11, rådjur¹², mongoose^13,fladdermus^14,kanin^15,,16, vildsvin¹⁷ och många fler^7,,18,19, som visar zoonos^7,,20,,21,22. Förutom otillräckliga sanitära förhållanden²³ och förorenade livsmedelsprodukter^{12,,24,,25,26,}överföring via blodtransfusion och organtransplantationer är också möjligt^27,28. HEV är en vanlig orsak till levercirros och leversvikt²⁹ särskilt hos patienter med redan existerande leversjukdom, immunkomprometterade individer (genotyp 3, 4 och 7) och gravida kvinnor (genotyp 1). Observera att det också finns extrahepatiska manifestationer som hematopoietisk sjukdom^30,,31,32, neurologiska sjukdomar³³ och njurskada³⁴.

Hittills är off-label drogen ribavirin (RBV) behandling av val för många infekterade patienter^35,36. Fall av behandlingssvikt och dåliga kliniska långsiktiga resultat har dock rapporterats. Behandlingssvikt har kopplats till viral mutagenesis och ökad viral heterogenitet hos kroniskt infekterade patienter^37,38,39. Tvärtom kunde en nyligen genomförd europeisk retrospektiv multicenterstudie inte korrelera polymerasmutationer med RBV-behandlingssvikt⁴⁰. I kliniska observationer och in vitro-experiment, interferon^41,42,43, sofosbuvir^44,45, zinksalter⁴⁶ och silvestrol^47,48 har också visat antivirala effekter. Icke desto mindre återstår en specifik HEV behandling att finna, hämmas av bristen på kunskap om HEV livscykel och dess patogenes. Därför behövs ett robust cellodlingssystem för virologiska studier och utveckling av nya antivirala läkemedel⁴⁹.

Tyvärr, liksom andra hepatit virus, HEV är svårt att sprida sig i konventionella cellinjer och oftast fortskrider mycket långsamt leder till låga virusbelastningar. Ändå, vissa grupper kunde öka virusbelastningar av generering av cellinje subkloner⁵⁰ eller justering av media kosttillskott⁵¹. Nyligen generering av cDNA kloner⁵² och anpassning av primära patienten isolat genom att passera^53,54 ytterligare förbättrad HEV förökning i cellkultur⁵⁵. I detta protokoll använde vi arvsmassan hos en cellkultur anpassad Kernow-C1 stam (kallad p6_WT)⁵⁴ och en mutant stam som hyser en replikeringshöjande mutation (kallad p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 är den mest använda stammen i HEV cellkultur och kan producera höga virusbelastningar. Genom att bedöma virala RNA-kopieringsnummer kan HEV-replikation övervakas in vitro. Dessa tekniker tillåter dock inte bedömning av antalet smittsamma partiklar som produceras. Därför har vi etablerat en immunofluorescensfärgning för att bestämma Fokusbildande enheter (FFU/mL).

Den här beskrivna metoden⁵⁶ kan användas för att producera full längd infektiösa viruspartiklar som kan infektera en mängd olika celltyper från olika ursprung, inklusive primära celler och däggdjurs cellinjer. Detta är en grundläggande förutsättning för att dechiffrera viktiga aspekter av HEV-infektion och tropism. Det finns inget behov av inokulering med vanligtvis begränsade patientisolat. Produktionen av infektiösa HEV-partiklar från plasmider utgör en oändlig källa, vilket gör detta protokoll jämförbart effektivt. Dessutom kan detta system användas för omvänd genetik som möjliggör studier av in vivo-identifierade genomförändringar och deras inverkan på HEV-replikation och kondition. Denna teknik övervinner många begränsningar och, kan väg vägen för läkemedelsutveckling, mutagenesis studier och utvärdering av virus-värd interaktioner såsom begränsning eller faktorer inträde.