Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Beständen mit hohem Titer

Hepatitis E ist eine ziemlich unterschätzte Krankheit mit zunehmender Verbreitung weltweit. Etwa 20 Millionen Infektionen führen zu mehr als 70.000 Todesfällen pro Jahr¹. Das zugrunde liegende Mittel, das Hepatitis-E-Virus (HEV), wurde vor kurzem neu zugewiesen und ist nun in der Familie Hepeviridae einschließlich der Gattungen Orthohepevirus und Piscihepevirus klassifiziert. HEV verschiedener Herkunft werden innerhalb der Art Orthohepevirus A-D einschließlich Isolate n. Mensch, Schwein, Kaninchen, Ratten, Vögel und andere Säugetiere²eingestuft. Derzeit wurden acht verschiedene Genotypen (GT) des positiv-orientierten, einsträngigen RNA-Virus identifiziert². Obwohl sie sich in ihrer Sequenzidentität, den Übertragungswegen und der geographischen Verteilung unterscheiden, ist ihre genomische Struktur stark konserviert. Genauer ist, dass das 7,2 kbp HEV Genom in 3 große offene Leserahmen (ORF1-3) unterteilt ist. Während ORF1 alle Enzyme kodiert, die für eine erfolgreiche Replikation innerhalb der Hostzelle benötigt werden, kodiert ORF2 das Capsid-Protein und das ORF3-Protein als funktioneller Ionenkanal, der für die Montage und Freisetzung von Infektiöse^Partikelnbenötigt wird 3 . Einmal in das Basal- oder apikales Lumen freigesetzt, existiert HEV sowohl bei quasi umhüllten als auch bei nicht umhüllten/nackten Arten, je nachdem, ob das Virus aus Blut oder Kot stammt bzw.^4,5.

Während GT1 und GT2 hauptsächlich in Entwicklungsländern gefunden werden, die Menschen⁶ nur über den fäkal-oralen Weg infizieren, GT3, GT4 und GT7 kommen vorwiegend in entwickelten Ländern^1,7 mit einer Vielzahl von Arten als Reservoirs dienen, z.B., Schweine⁸, Ratte⁹, Huhn^10,11, Hirsch¹², Mongoose¹³, Fledermaus¹⁴, Kaninchen^15,16, Wildschwein¹⁷ und viele mehr 7^7,18,19, beweise Zoonose^7,20,21,22. Neben unzureichenden sanitären Bedingungen²³ und kontaminierte Lebensmittel^12,24,25,26, Übertragung über Bluttransfusion und Organtransplantationen ist auch möglich^27,28. HEV ist eine häufige Ursache für Leberzirrhose und Leberversagen²⁹ vor allem bei Patienten mit bereits bestehenden Lebererkrankungen, immungeschwächten Personen (Genotyp 3, 4 und 7) und Schwangeren (Genotyp 1). Bemerkenswert ist, dass es auch extrahepatische Manifestationen wie hämatopoetische Erkrankungen^30,31,32, neurologische Erkrankungen³³ und Nierenverletzungen³⁴.

Bis heute ist das off-Label-Medikament Ribavirin (RBV) die Behandlung der Wahl für viele infizierte Patienten^35,36. Jedoch, Fälle von Behandlungsversagen und schlechte klinische langfristige Ergebnisse wurden berichtet. Behandlungsversagen wurde mit viraler Mutagenese und erhöhter viraler Heterogenität bei chronisch infizierten Patienten^37,38,39zusammengebracht. Im Gegenteil, eine kürzlich durchgeführte europäische retrospektive multizentrische Studie war nicht in der Lage, Polymerase-Mutationen mit Einem Fehler bei der RBV-Behandlung⁴⁰zu korrelieren. In klinischen Beobachtungen und In-vitro-Experimenten haben Interferon^41,42,43, sofosbuvir^44,45, Zinksalze⁴⁶ und Silvestrol^47,48 ebenfalls antivirale Wirkungen gezeigt. Dennoch bleibt eine spezifische HEV-Behandlung zu finden, die durch das mangelnde Wissen über den HEV-Lebenszyklus und seine Pathogenese behindert wird. Daher ist ein robustes Zellkultursystem für virologische Studien und die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente dringend erforderlich⁴⁹.

Leider ist HEV, wie andere Hepatitis-Viren, in konventionellen Zelllinien schwer zu vermehren und entwickelt sich in der Regel sehr langsam, was zu niedrigen Virusbelastungen führt. Dennoch waren einige Gruppen in der Lage, die Viruslast durch die Erzeugung von Zelllinien-Subklonen⁵⁰ oder die Einstellung von Medienergänzungen⁵¹zu steigern. Kürzlich die Erzeugung von cDNA-Klone⁵² und die Anpassung von Primären-Patientenisolaten durch Passaging^53,54 weiter verbesserte HEV-Vermehrung in der Zellkultur⁵⁵. In diesem Protokoll verwendeten wir das Genom eines zellkulturangepassten Kernow-C1-Stamms (bezeichnet als p6_WT)⁵⁴ und einen mutierten Stamm, der eine replikationsverstärkende Mutation (p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 ist die am häufigsten verwendete Sorte in der HEV-Zellkultur und ist in der Lage, hohe Viruslasten zu produzieren. Durch die Bewertung viraler RNA-Kopierzahlen kann die HEV-Replikation in vitro überwacht werden. Diese Techniken erlauben jedoch keine Bewertung der Anzahl der erzeugten infektiösen Partikel. Daher haben wir eine Immunfluoreszenzfärbung zur Bestimmung von Fokusbildungseinheiten (FFU/ml) etabliert.

Die hier beschriebene Methode⁵⁶ kann verwendet werden, um infektiöse Viruspartikel in voller Länge zu produzieren, die in der Lage sind, eine Vielzahl von Zelltypen unterschiedlicher Herkunft zu infizieren, einschließlich Primärzellen und Säugetierzelllinien. Dies ist eine grundvoraussetzung, um wichtige Aspekte der HEV-Infektion und des Tropismus zu entschlüsseln. Es besteht keine Notwendigkeit für impfungen mit in der Regel begrenzten Patientenisolaten. Die Produktion von infektiösen HEV-Partikeln aus Plasmiden stellt eine unendliche Quelle dar, die dieses Protokoll vergleichsweise effizient macht. Darüber hinaus kann dieses System für die Reverse-Genetik verwendet werden, die die Untersuchung der in vivo identifizierten Genomveränderung und ihrer Auswirkungen auf die HEV-Replikation und -Fitness ermöglicht. Diese Technik überwindet viele Einschränkungen und kann den Weg für die Arzneimittelentwicklung, Mutagenesestudien und die Bewertung von Virus-Host-Wechselwirkungen wie Restriktions- oder Eintrittsfaktoren ebnen.