Een cel cultuur model voor de productie van hoge titer hepatitis E virus voorraden

Hepatitis E is een vrij onderschatte ziekte met toenemende prevalentie wereldwijd. Ongeveer 20 miljoen infecties resulteren in meer dan 70.000 sterfgevallen per jaar¹. Het onderliggende middel, het Hepatitis E-virus (HEV), werd onlangs overgeplaatst en is nu ingedeeld binnen de familie Hepeviridae, waaronder het geslacht Orthohepevirus en het Piscihepevirus. HEV van verschillende oorsprong zijn ingedeeld binnen de soort Orthohepevirus A-D met inbegrip van isolaten van mensen, varkens, konijnen, ratten, vogels en andere zoogdieren². Op dit moment zijn acht verschillende genotypes (GT) van het positief georiënteerde, enkelstrengs RNA-virus geïdentificeerd². Hoewel ze verschillen in hun sequentie-identiteit, routes van transmissie en geografische spreiding, is hun genomische structuur zeer behouden. Meer specifiek, de 7.2 kbp HEV genoom is verdeeld in 3 grote open leesframes (ORF1-3). Terwijl ORF1 alle enzymen codeert die nodig zijn voor een succesvolle replicatie binnen de hostcel, codeert ORF2 het capsid-eiwit en werkt het ORF3-eiwit als een functioneel ionenkanaal dat nodig is voor de assemblage en afgifte van infectieuze deeltjes³. Eenmaal vrijgegeven in de basale of apical lumen HEV bestaat in zowel, quasi-veloped en niet-gehulde / naakte soorten, afhankelijk van de vraag of het virus afkomstig is van bloed of uitwerpselen, respectievelijk^4,5.

Terwijl GT1 en GT2 zijn vooral te vinden in ontwikkelingslanden uitsluitend infecteren mensen⁶ via de fecale orale route, GT3, GT4 en GT7 komen voornamelijk voor in ontwikkelde landen^1,7 met een verscheidenheid aan soorten die als reservoirs, b.v. varkens⁸, rat⁹, kip^10,11, herten¹², mongoose¹³, vleermuis¹⁴, konijn^15,16, wilde zwijnen¹⁷ en nog veel meer^7,18,19, die aantonen dat zoönose^7,20,21,22. Naast ontoereikende hygiënische omstandigheden²³ en besmette voedingsproducten^12,24,25,26, is overdracht via bloedtransfusie en orgaantransplantaties ook mogelijk^27,28. HEV is een veel voorkomende oorzaak van levercirrose en leverfalen²⁹ vooral bij patiënten met reeds bestaande leverziekte, immuungecompromitteerde individuen (genotype 3, 4 en 7) en zwangere vrouwen (genotype 1). Van belang zijn er ook extrahepatische manifestaties zoals hematopoietische ziekte^30,31,32, neurologische aandoeningen³³ en nierletsel³⁴.

Tot op heden is het off-label medicijn ribavirin (RBV) de keuzebehandeling voor veel geïnfecteerde patiënten^{van 35,36}. Er zijn echter gevallen van falen van de behandeling en slechte klinische resultaten op lange termijn gemeld. Het falen van de behandeling is gekoppeld aan virale mutagenese en verhoogde virale heterogeniteit bij chronisch geïnfecteerde patiënten^37,38,39. Integendeel, een recente Europese retrospectieve multicenter studie was niet in staat om polymerase mutaties te correleren met RBV behandeling falen⁴⁰. In klinische waarnemingen en in vitro experimenten hebben interferon^41,42,43, sofosbuvir^44,45, zinkzouten⁴⁶ en silvestrol^47,48 ook antivirale effecten vertoond. Niettemin moet er nog een specifieke HEV-behandeling worden gevonden, die wordt belemmerd door het gebrek aan kennis over de HEV-levenscyclus en de pathogenese ervan. Daarom is een robuust celkweeksysteem voor virologische studies en de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen dringend nodig⁴⁹.

Helaas, net als andere hepatitis virussen, HEV is moeilijk te verspreiden in conventionele cellijnen en meestal vordert zeer langzaam leidt tot lage virale belastingen. Niettemin, sommige groepen waren in staat om virale belastingen te stimuleren door de generatie van de cellijn subklonen⁵⁰ of de aanpassing van de media supplementen⁵¹. Onlangs is de generatie van cDNA klonen⁵² en de aanpassing van de primaire patiënt isolaten door passaging^53,54 verder verbeterde HEV voortplanting in celcultuur⁵⁵. In dit protocol gebruikten we het genoom van een celcultuur aangepaste Kernow-C1 stam (aangeduid als p6_WT)⁵⁴ en een mutant stam herbergen een replicatie-verbeterende mutatie (aangeduid als p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 is de meest gebruikte stam in HEV celcultuur en is in staat om hoge virale belastingen te produceren. Door het beoordelen van virale RNA kopie nummers, HEV replicatie kan worden gecontroleerd in vitro. Deze technieken maken het echter niet mogelijk om het aantal besmettelijke deeltjes te beoordelen. Daarom hebben we een immunofluorescentie kleuring vastgesteld om Focus Forming Units (FFU/mL) te bepalen.

De hier beschreven methode⁵⁶ kan worden gebruikt om infectieuze virale deeltjes over de hele lengte te produceren die in staat zijn om een verscheidenheid aan celtypen van verschillende oorsprong te infecteren, waaronder primaire cellen en zoogdiercellijnen. Dit is een fundamentele voorwaarde om belangrijke aspecten van HEV-infectie en tropisme te ontcijferen. Er is geen noodzaak voor inenting met meestal beperkte patiënt isolaten. De productie van besmettelijke HEV-deeltjes uit plasmiden vormt een oneindige bron, wat dit protocol vergelijkbaar efficiënt maakt. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor omgekeerde genetica waardoor in vivo geïdentificeerde genoomwijziging en hun impact op HEV-replicatie en fitness mogelijk zijn. Deze techniek overwint vele beperkingen en kan de weg vinden voor medicijnontwikkeling, mutagenesestudies en de evaluatie van virushostinteracties zoals beperking of toegangsfactoren.