מודל תרבות התא להפקת צהבת מניות וירוס מסוג Titer גבוהה

צהבת E היא מחלה די מזלזל עם שכיחות גוברת ברחבי העולם. כ 20,000,000 זיהומים לגרום ליותר מ 70,000 מקרי מוות בשנה¹. הסוכן הבסיסי, וירוס הפטיטיס (שלום), הוצב מחודש לאחרונה והוא מסווג כיום בתוך המשפחה Hepe, כולל הנגיף האורתופהווירוס ו piscihepevirus. האוהב של מקורות שונים מסווג בתוך מינים Orthohepevirus A-D כולל מבודד מבני אדם, חזיר, ארנבים, חולדות, ציפורים ויונקים אחרים². בזמן הנוכחי, שמונה גנוסוגים שונים (GT) של חיובי, וירוס יחיד שנתקע RNA זוהו². למרות שהם נבדלים בזהות הרצף שלהם, נתיבי שידור והפצה גיאוגרפית, מבנה גנומית שלהם הוא שימור מאוד. יותר ספציפי, הגנום 7.2 kbp האוהב מחולק ל 3 מסגרות קריאה הגדול פתוח (ORF1 -3). בעוד ORF1 מקודד את כל האנזימים הדרושים עבור שכפול מוצלח בתא המארח, ORF2 מקודד את חלבון הקפיסיד, והחלבון ORF3 מתפקד כערוץ יונים פונקציונלי הנדרש להרכבה ושחרור של חלקיקים זיהומיות³. שוחרר פעם לתוך הבסיס או לומן פסגה חי קיים בשני, quasienveloped ו מינים לא עטוף/עירום תלוי אם הנגיף מקורו דם או צואה, בהתאמה^4,5.

בעוד GT1 ו GT2 נמצאים בעיקר במדינות מתפתחות רק מדביק את בני האדם⁶ דרך הדרך הצואה אוראלי, GT3, GT4 ו GT7 מתרחשים בעיקר במדינות מפותחות^1,7 עם מגוון של מינים המשרתים כמו מאגרים, למשל, חזיר⁸, חולדה⁹, עוף^10,11, צבי¹²,^,22נמייה¹³, בת¹⁴, ארנב^15,16, בר חזיר¹⁷ ועוד הרבה יותר^7,18,19, מתן ראיות של zoonosis^7,20,21 בנוסף לתנאים הסניטריים מספיק²³ ומוצרי מזון מזוהם^12,24,25,26, העברה באמצעות עירוי דם ושתילת איברים ניתן גם כן^27,28. אוהב הוא גורם נפוץ של שחמת הכבד וכישלון הכבד²⁹ במיוחד בחולים עם מחלת הכבד הקיימים מראש, אנשים בסיכון חיסוני (גנוטיפ 3, 4 ו 7) ונשים הרות (גנוטיפ 1). של הערה, יש גם ביטויים מחוץ לכבד כגון מחלה המטפאות^30,31,32, הפרעות נוירולוגיות³³ ופציעה הכליה³⁴.

עד כה, התרופה מחוץ לתווית ריבוירין (rbv) היא הטיפול בבחירה עבור חולים רבים נגועים^35,36. עם זאת, דווח על מקרים של כישלון הטיפול והתוצאות הרפואיות העניות לטווח הארוך דווחו. כישלון הטיפול נקשר מוטגנזה ויראלית ומוגברת טרוגניות ויראלי בחולים³⁷נגועים באופן^{כרוני 37,38,39}. להפך, האחרונה רטרוספקטיבי האירופי הכנס למחקר לא היה מסוגל לתאם פולימונאז מוטציות לכשל הטיפול RBV⁴⁰. בתצפיות קליניות ובניסויים מחוץ למבחנה, אינטרפרון^41,42,43, sofosbuvir^44,45, מלחי אבץ⁴⁶ ו-סילברול⁴⁷,⁴⁸ הראו גם אפקטים אנטי-^{ויראליים}. למרות זאת, טיפול מסוים בנושא החיים נותר להימצא, והוא מושפע מחוסר הידע על מחזור חיי החיות והפתוגנזה שלה. לפיכך, מערכת תרבות תא חזקה למחקרים וירולוגיים ופיתוח תרופות אנטי-ויראליות חדשות, נחוצה בדחיפות⁴⁹.

למרבה הצער, כמו וירוסים אחרים הפטיטיס, כלומר, קשה להפיץ בקווי התא קונבנציונאלי בדרך כלל מתקדם לאט מאוד מוביל ויראלי נמוך עומסים. אף על פי כן, קבוצות מסוימות הצליחו להגביר את העומסים ויראלי על ידי הדור של קו התא subclones⁵⁰ או התאמה של תוספי מדיה⁵¹. לאחרונה הדור של cdna שיבוטים⁵² ו עיבוד של המטופל הראשי מבודד על ידי passaging^53,54 הפצת האוהב משופרת נוסף בתרבות התא⁵⁵. בפרוטוקול זה, השתמשנו הגנום של תרבות התא הותאם מאמץ Kernow-C1 (המכונה p6_WT)⁵⁴ ו מוטציה זן מחסה מוטציה שיפור שכפול (המכונה p6_G1634R)³⁷. Kernow-C1 הוא זן הנפוץ ביותר בתרבות תא מאוהב והוא מסוגל לייצר עומסים ויראלי גבוהה. על ידי הערכת ויראלי מספרים העתק RNA, שכפול האוהב יכול להיות מנוטרים בתוך מבחנה. עם זאת, טכניקות אלה אינן מאפשרות הערכה של מספר החלקיקים הזיהומיות המיוצרים. לכן, יש לנו הקימה מודלובורנציה כתמים כדי לקבוע מיקוד ויוצרים יחידות (FFU/mL).

השיטה המתוארת כאן⁵⁶ יכולה לשמש להפקת חלקיקים ויראליים מדבקים באורך מלא, המסוגלים להדביק מגוון סוגי תאים ממקורות שונים, כולל תאים ראשוניים וקווי תאים. זהו תנאי מוקדם בסיסי לפענח היבטים חשובים של זיהום והטרוריזם. אין צורך בחיסונים. בדרך כלל מוגבלים בחולים הייצור של חלקיקי אוהב זיהומיות מפלמידים מהווה מקור אינסופי, מה שהופך פרוטוקול זה זהובה יעיל. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש עבור הגנטיקה הפוכה המאפשרת את המחקר של שינוי הגנום מזוהה vivo ואת השפעתם על שכפול וכושר. טכניקה זו גוברת על מגבלות רבות, ויכולה לסלול את הדרך להתפתחות הסמים, ללימודי מוטגנזה ולהערכת אינטראקציות של מארחי וירוסים כגון מגבלות או מקדמי כניסה.