Den nuværende protokol demonstrerer en enkel metode til sporing af ventral tegmental område (VTA) glutamat fremskrivninger til hippocampus. Photostimulation af VTA glutamat neuroner blev kombineret med CA1 optagelse for at demonstrere, hvordan VTA glutamat terminaler modulere CA1 formodede pyramide fyring sats in vivo.
Optogenetisk graduering af neuron subpopulationer i hjernen har gjort det muligt for forskere at dissekere neurale kredsløb in vivo og ex vivo. Dette giver en forudsætning for at bestemme neurontypernes rolle i et neuralt kredsløb og deres betydning i informationskodning i forhold til læring. Ligeledes kan metoden bruges til at teste den fysiologiske betydning af to eller flere forbundne hjerneregioner i vågne og bedøvede dyr. Den nuværende undersøgelse viser, hvordan VTA glutamat neuroner modulere fyring sats formodede pyramide neuroner i CA1 (hippocampus) af bedøvede mus. Denne protokol anvender adeno-associeret virus (AAV) afhængig mærkning af VTA glutamat neuroner til sporing af VTA presynaptic glutamat terminaler i lagene af hippocampus. Ekspression af lysstyret opsin (channelrhodopsin; hChR2) og fluorescensprotein (eYFP), der næres af AAV-vektoren, tilladte anterograde-sporing af VTA glutamatterminaler og fototimulation af VTA glutamat neuroncellelegemer (i VTA). Høj impedans akutte silicium elektroder blev placeret i CA1 til at opdage multi-enhed og enkelt-enhed reaktioner på VTA photostimulation in vivo. Resultaterne af denne undersøgelse viser den lagafhængige fordeling af præsynaptiske VTA glutamatterminaler i hippocampus (CA1, CA3 og GD). Også, den photostimulation af VTA glutamat neuroner øget fyring og brast sats formodede CA1 pyramideenheder in vivo.
I det sidste årti blev en række genetiske værktøjer udviklet for at øge specificiteten af neuron-type graduering og kortlægning af komplekse neurale netværk1. Især neurotropiske vira med en iboende evne til at inficere og replikere i neuronale celler er blevet indsat for at udtrykke eller ablate specifikke proteiner i neuron sub-typer. Når der huser fluorescens proteiner eller genetisk kodet synaptiske aktivitetsindikatorer, transfected AAV vektorer etiket og afgrænse neurale netværk på tværs af hjernen regioner2,3. Valget af en promotor i AAV-konstruktionen dirigerer vektorens udtryk i neurontyper med en vis specificitet(promotorafhængigt udtryk). Men gennem Cre-lox rekombination, AAV konstruktioner er indsat med større specificitet for neuron mærkning4,5,6,7. Bemærk, fotoaktiverede mikrobielle opsiner og fluorescensproteiner pakket i AAV-vektorer kan udtrykkes i forskellige neuronundertyper8og er ideelle til billeddannelse, neuron-type kredsløbssporing og fotomodulation9,10.
AAV’er konstruerer stereotaktisk injiceres i en hjerne region (eller kerne) drev udtryk for reporter protein i soma, dendrit, og axoner terminaler. Neurale udtryk for AAV huser en reporter gen (eYFP) letter mærkning af neuron celle organer og anatomiske sporing af fremskrivninger til og fra andre hjerne regioner11,12,13,14. AAV-eYFP konstruerer transporterer lys-kontrolleret opsin (f.eks hChR2), kan anvendes som et redskab til billeddannelse6,15 og stimulation-baserede fysiologiske sporing af neurale fremskrivninger til at målrette hjernen områder in vivo16. Afhængigt af AAV-serotypen kan retningen af neuronmærkning være anterograde eller retrograd11,12. Tidligere undersøgelser har fastslået, at AAV5 rejser anterogradely i neuroner12. Således photostimulation af celle organer udtrykke hChR2 producerer præsynaptiske virkninger andre steder i hjernen (mål)17.
Her blev AAV (serotype 5) med en CaMKIIα promotor brugt til at udtrykke eYFP (reporter) og hChR2 (opsin) i VTA glutamat neuroner og axonale fremskrivninger. Resultaterne fra denne undersøgelse viser den lagafhængige fordeling af præsynaptiske VTA-glutamatterminaler i CA1-, CA3- og GD hippocampal-regionerne. Også, photostimulation af VTA glutamat neuroner øget CA1 multi-enhed og enkelt-enhed fyring satser in vivo sammenlignet med baseline værdier. Denne protokol bruger overkommelige værktøjer og kommercielt tilgængelig software, der kan øge kvaliteten af data opnået fra neurale kredsløbssporingseksperimenter.
I det seneste årti er designet af AAV-konstruktioner avanceret betydeligt. Som sådan er mere neuron-specifikke initiativtagere blevet indarbejdet i en række AAV-serotyper for forbedret transfektspecifikitet14. Ved at kombinere gener for fluorescensproteiner, transportører, receptorer og ionkanaler findes der nu biblioteker af AAV til billeddannelse, neuromodulation og synaptisk aktivitetsdetektion. I kommercielt tilgængelige AAV-konstruktioner giver en kombination af en genetisk kodet fluorop…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er finansieret af CBS Bridging Grant tildelt OOM. OOM, PAA og AS designede undersøgelsen og udførte eksperimenterne. AS og PAA analyserede resultaterne. OOM og PAA forberedte manuskriptet. Vi takker Dr. Karl Disseroth (Stanford University) for at gøre AAV til rådighed for vores brug.
3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
BNC cable | Amazon | ||
BNC Splitter | Amazon | ||
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
Drill | Dremel | LR 39098 | |
Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Ketamine | Spectrum | K1068 | |
LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
Urethane | Sigma | U2500 | |
Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
Software | Company | Version | |
Graphpad Prism | |||
Intan Recording Controller | |||
Neuroexplorer | |||
Plexon Offline Spike Sorter | |||
ACSF Composition: | |||
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |