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发育生物学

Casting vascolare di polmoni di mouse postnatali adulti e precoci per l'imaging Micro-CT

Published: June 20, 2020
doi:
10.3791/61242
, , , , , , ,
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute,National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke,National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Lo scopo di questa tecnica è la visualizzazione ex vivo delle reti arteriliiche polmonari dei primi topi postnatali e adulti attraverso l’inflazione polmonare e l’iniezione di un composto a base di polimeri radio-opaco attraverso l’arteria polmonare. Vengono inoltre discusse le potenziali applicazioni per i tessuti castati.

Abstract

I vasi sanguigni formano reti intricate nello spazio tridimensionale. Di conseguenza, è difficile apprezzare visivamente il modo in cui le reti vascolari interagiscono e si comportano osservando la superficie di un tessuto. Questo metodo fornisce un mezzo per visualizzare la complessa architettura vascolare tridimensionale del polmone.

Per raggiungere questo obiettivo, un catetere viene inserito nell’arteria polmonare e la vascolatura viene simultaneamente lavata di sangue e dilatata chimica per limitare la resistenza. I polmoni vengono poi gonfiati attraverso la trachea a una pressione standard e il composto polimerico viene infuso nel letto vascolare ad una velocità di flusso standard. Una volta che l’intera rete arteriosa è stata riempita e autorizzata a curare, la vascolatura polmonare può essere visualizzata direttamente o su uno scanner micro-CT.

Quando eseguito con successo, si può apprezzare la rete arteriosa polmonare nei topi che vanno dalle prime età postnatali agli adulti. Inoltre, mentre dimostrato nel letto arteriosa polmonare, questo metodo può essere applicato a qualsiasi letto vascolare con posizionamento del catetere ottimizzato e punti finali.

Introduction

Il focus di questa tecnica è la visualizzazione dell’architettura arteriosa polmonare utilizzando un composto a base di polimeri nei topi. Mentre è stato eseguito un ampio lavoro su letti vascolari sistemici come cervello, cuore e rene1,2,3,4,5, sono disponibili meno informazioni per quanto riguarda la preparazione e il riempimento della rete arteriosa polmonare. Lo scopo di questo studio, quindi, è quello di ampliare il lavoroprecedente 6,7,8 e fornire un riferimento scritto e visivo dettagliato che i ricercatori possono facilmente seguire per produrre immagini ad alta risoluzione dell’albero arteriosa polmonare.

Mentre esistono numerosi metodi per l’etichettatura e l’imaging della vascolatura polmonare, come la risonanza magnetica, l’ecocardiografia o l’angiografiaTC 9,10, molte di queste modalità non riescono a riempire adeguatamente e/o catturare i piccoli vasi, limitando la portata di ciò che può essere studiato. Metodi come la sezionazione seriale e la ricostruzione forniscono alta risoluzione, ma sono tempo/lavoro ad altaintensità di tempo 11,12,13. L’integrità dei tessuti molli circostante è compromessa nella colata di corrosionetradizionale 10,,13,14,15,16. Anche l’età e le dimensioni degli animali diventano fattori quando si tenta di introdurre un catetere o, la risoluzione è carente. La tecnica di iniezione polimerica, d’altra parte, riempie le arterie al livello capillare e, se combinata con la CT, consente una risoluzione senza precedenti5. I campioni dei polmoni di topo giovani come il giorno postnatale 14 sono stati lanciaticon successo 8 ed elaborati in poche ore. Questi possono essere riscanci a tempo indeterminato, o addirittura inviati per preparazione irologica/ microscopia elettronica (EM) senza compromettere il tessuto molleesistente 17. Le principali limitazioni di questo metodo sono il costo iniziale delle apparecchiature/software CT, le sfide con il monitoraggio accurato della pressione intravascolare e l’incapacità di acquisire dati longitudinalmente nello stesso animale.

Questo documento si basa sul lavoro esistente per ottimizzare ulteriormente la tecnica di iniezione dell’arteria polmonare e spingere i confini relativi all’età/dimensione fino al giorno postnatale 1 (P1) per produrre risultati sorprendenti. È più utile per i team che vogliono studiare le reti vascolari arteriose. Di conseguenza, forniamo nuove linee guida per il posizionamento/stabilizzazione del catetere, un maggiore controllo sulla frequenza/volume di riempimento ed evidenziamo notevoli insidie per un maggiore successo di colata. I cast risultanti possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione futura e l’analisi morfologica. Forse ancora più importante, questa è la prima dimostrazione visiva, a nostra conoscenza, che guida l’utente attraverso questa procedura complessa.

Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) del National Heart Lung and Blood Institute. 1. Preparazione Iniettare il topo intraperitonealmente con epatina (1 unità/g peso corporeo del topo) e lasciare che ambulate per 2 min. Eutanasia l’animale in una camera di CO2. Disporre il mouse in posizione supina su una tavola chirurgica e fissare tutti e quattro gli arti alla scheda con del nastro a…

Representative Results

Un cast di successo mostrerà un riempimento uniforme dell’intera rete arteriosa polmonare. Lo dimostriamo nei topi C57Bl/6J che variano in età: giorno postnatale P90 (Figura 4A), P30 (Figura 4B), P7 (Figura 4C) e P1 (Figura 4D). Controllando la velocità del flusso e monitorando visivamente il riempimento in tempo reale, sono stati raggiunti endpoint affidabili della v…

Discussion

Eseguito correttamente, questo metodo produce immagini sorprendenti di reti arteriose polmonari, consentendo il confronto e la sperimentazione nei modelli di roditori. Diversi passaggi critici lungo il percorso garantiscono il successo. In primo luogo, i ricercatori devono eparinizzare l’animale nella fase preparatoria per evitare che si forno coaguli di sangue nella vascolatura polmonare e nelle camere del cuore. Ciò consente il transito arteriosa completo del composto polimero. In secondo luogo, quando si perfora il d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale NHLBI (DIR HL-006247). Ringraziamo il NIH Mouse Imaging Facility per la guida nell’acquisizione e nell’analisi delle immagini.

Materials

1cc syringe Becton Dickinson 309659
20ml Glass Scintillation Vials Fisher 03-340-25P
30G Needle Becton Dickinson 305106
50mL conical tubes Cornin 352098 For sample Storage and scanning
60cc syringe Becton Dickinson 309653
7-0 silk suture Teleflex 103-S
Analyze 12.0 Software AnalyzeDirect Inc. N/A Primary Software
Amira 6.7 Software Thermo Scientific N/A Alternative Sofware
CeramaCut Scissors 9cm Fine Science tools 14958-09
Ceramic Coated Curved Forceps Fine Science tools 11272-50
CO2 Tank Robert's Oxygen Co. n/a
Dual syringe pump Cole Parmer EW-74900-10
Dumont Mini-Forceps Fine Science tools 11200-14
Ethanol Pharmco 111000200
Formalin Sigma – Life Sciences HT501128
Gauze Covidien 441215
Hemostat Fine Science tools 13013-14
Heparin (1000USP Units/ml) Hospira NDC 0409-2720-01
Horos Software Horos Project N/A Alternative Sofware
induction chamber n/a n/a
Kimwipe Fisher 06-666 fiber optic cleaning wipe
Labelling Tape Fisher 15966
Magnetic Base Kanetec N/A
Micro-CT system SkyScan  1172
Microfil (Polymer Compound) Flowech Inc. Kit B – MV-122 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent
Micromanipulator Stoelting 56131
Monoject 1/2 ml Insulin Syringe Covidien 1188528012
Octagon Forceps Straight Teeth Fine Science tools 11042-08
Parafilm Bemis company, Inc. #PM999
PE-10 tubing Instech BTPE-10
Phospahte buffered Saline BioRad #161-0780
Ring Stand Fisher S13747 Height 24in.
Sodium Nitroprusside sigma 71778-25G
Steel Plate N/A N/A 16 x 16 in. area, 1/16 in thick
Straight Spring Scissors Fine Science tools 15000-08
SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter Santa Cruz Biotechnology 360103
Surgical Board Fisher 12-587-20 This is a converted slide holder
Universal 3-prong clamp Fisher S24280
Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing Nipro PR25G19
Zeiss Stemi-508 Dissection Scope Zeiss n/a
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Knutsen, R. H., Gober, L. M., Sukinik, J. R., Donahue, D. R., Kronquist, E. K., Levin, M. D., McLean, S. E., Kozel, B. A. Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61242, doi:10.3791/61242 (2020).
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