Оценка клеточного окисления с помощью подклеточного сулярного редокса-чувствительного зеленого флуоресцентного белка
Summary
Этот протокол описывает оценку субклеточного отсека-специфического редокса статуса в клетке. Красный флуоресцентный зонд, чувствительный к редоксу, позволяет проводить удобный коэффициентометрический анализ в нетронутых клетках.
Abstract
Измерение внутриклеточного окисления/снижения баланса обеспечивает обзор физиологического и/или патофизиологического редокса состояние организма. Тиолы особенно важны для освещения состояния редокса клеток через их снижение дитиола и окислимых коэффициентов дисульфида. Инженерные цистеин-содержащие флуоресцентные белки открывают новую эру для редокс чувствительных биосенсоров. Один из них, редокс чувствительных зеленый флуоресцентный белок (roGFP), может быть легко введен в клетки с аденовирусной трансдукции, что позволяет редокс статус субклеточных отсеков, которые будут оцениваться без нарушения клеточных процессов. Снижение цистеин и окислившиеся цистины roGFP имеют экзцинацию максимум на 488 нм и 405 нм, соответственно, с выбросом на 525 нм. Оценка соотношения этих уменьшенных и окислимых форм позволяет удобное расчет баланса редокса внутри клетки. В этой статье метода, увековеченные человека тройной отрицательный раковых клеток молочной железы (MDA-MB-231) были использованы для оценки состояния redox в живой клетке. Протокол шаги включают MDA-MB-231 клеточной линии трансдукции с аденовирусом, чтобы выразить цитозолик roGFP, лечение H2O2, и оценка цистеина и цистина соотношение как с потоком цитометрии и флуоресценции микроскопии.
Introduction
Окислительный стресс был определен в 1985 году Гельмут Сис как “нарушение в прооксидант-антиоксидантный баланс в пользупервого” 1, и множество исследований было проведено для получения болезни, питания, и старения конкретных редокс статус организмов1,2,3. С тех пор понимание окислительного стресса стало шире. Тестирование гипотез использования антиоксидантов против болезней и/или старения показало, что окислительный стресс не только причиняет вред, но и имеет другие роли в клетках. Кроме того, ученые показали, что свободные радикалы играют важную роль для переноса сигнала2. Все эти исследования усиливают важность определения изменений в соотношении макромолекулов. Активность ферментов, антиоксиданты и/или окислители, а также продукты окисления могут быть оценены различными методами. Среди них, методы, которые определяют окисление тиола, возможно, наиболее часто используются, потому что они сообщают о балансе между антиоксидантами и прооксидантами в клетках, а также организмов4. В частности, в качестве биомаркеров для мониторинга состояния редокса организмов2используются соотношения между глутатионе (GSH)/глутатион дисульфид (ГСГ) и/или цистеином (CySS).
Методы, используемые для анализа баланса между прооксидантами и антиоксидантами, полагаются главным образом на уровни пониженных/окислимых белков или мелких молекул в клетках. Западные помарки и масс-спектрометрия используются для широкой оценки соотношения уменьшенных/окислимых макромолекул (белков, липидов и т.д.), а коэффициенты GSH/GSSG можно оценить с помощью спектрофотометрии5. Общей чертой этих методов является физическое возмущение системы клеточным лизисом и/или гомогенизацией тканей. Эти анализы также становятся сложными, когда необходимо измерить состояние окисления различных клеточных отсеков. Все эти возмущения вызывают артефакты в среде анализа.
Редокс чувствительных флуоресцентных белков открыл выгодную эру для оценки баланса redox, не вызывая нарушения в клетках6. Они могут быть нацелены на различные внутриклеточные отсеки, что позволяет количественно определить отдельные действия (например, анализ состояния редокса митохондрий и цитозола) для исследования перекрестного разговора между клеточными органеллами. желтый флуоресцентный белок (YFP), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и белки HyPeR рассматриваются Мейером и коллегами6. Среди этих белков, редокс чувствительных GFP (roGFP) является уникальным из-за различных флуоресцентных считываний его CyS (например, 488 нм/em. 525 нм) и CySS (например, 405 нм/525 нм) остатки, что позволяет коэффициентический анализ, в отличие от других редокс чувствительных белков, таких как YFP7,8. Коэффициентометрический выход ценен тем, что уравновешивает различия между уровнями выражения, чувствительностью обнаружения и фотосъемки8. Подклеточные отсеки клеток (цитозол, митохондрии, ядра) или различных организмов (бактерий, а также клеток млекопитающих) могут быть направлены путем изменения roGFP7,9,10.
анализы roGFP проводятся с использованием методов флуоресцентной визуализации, особенно для экспериментов по визуализации в режиме реального времени. Цитометрический анализ цитометрических факторов roGFP также возможен для экспериментов с заранее определенными временными точками. Текущая статья описывает как использование флуоресцентной микроскопии и цитометрии потока для выполнения коэффициентной оценки состояния редокса в клетках млекопитающих, переэкспрессионных roGFP (направленных на цитосол) с помощью аденовирусной трансдукции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тиол/дисульфидный баланс в организме отражает состояние редокса клеток. В живых организмах есть глутатион, цистеин, белковые тиолы и низкомолекулярные тиолы, все из которых зависят от уровня окисления и повторяют редоксовый статус клеток4. Инженерные roGFPs позволяют ненару?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Конструкция и рекомбинантный аденовирус для выражения цитозолоспецифического roGFP в клетках были созданы в лаборатории Пола Т. Шумакера, PhD, Школы медицины Фрайберга, Северо-Западного университета и Vira’uest Inc., соответственно. Это исследование было поддержано Центром исследований принимающей ответ на рак терапии грант P20GM109005 через NIH Национальный институт общих медицинских наук Центры биомедицинских исследований Excellence (COBRE NIGMS), Национальный институт общих медицинских наук систем фармакологии и токсикологии Учебная программа грант T32 GM106999, Фонд UAMS/Медицинский исследовательский фонд премии AWD00053956, UAMS Год-Конец канцлера Награды AWD00053484. Ядро потока цитометрии ядро было поддержано в части Центра микробных патогенеза и принимающих воспалительных реакций грант P20GM103625 через COBRE NIGMS. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения НИЗ. ATA была поддержана Советом по научно-техническим исследованиям Турции (TUBITAK) 2214-A стипендией.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
- Sies, H. Oxidative stress: A concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Jones, D. P. Redefining Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signalling. 8 (9-10), (2006).
- Pizzino, G., et al. Oxidative Stress: Harms and Benefits for Human Health. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 20117, 8416763 (2017).
- Go, Y. M., Jones, D. P. Thiol/disulfide redox states in signaling and sensing. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 48 (2), 173-191 (2013).
- Hansen, J. M., Go, Y., Jones, D. P. Nuclear and Mitochondrial Compartmentation of Oxidative Stress and Redox Signaling. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 46 (1), 215-234 (2006).
- Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants and Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Björnberg, O., Østergaard, H., Winther, J. R. Measuring intracellular redox conditions using GFP-based sensors. Antioxidants and Redox Signaling. 8 (3-4), 354-361 (2006).
- Bhaskar, A., et al. Reengineering Redox Sensitive GFP to Measure Mycothiol Redox Potential of Mycobacterium tuberculosis during Infection. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003902 (2014).
- Loor, G., et al. Mitochondrial oxidant stress triggers cell death in simulated ischemia-reperfusion. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1813 (7), 1382-1394 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Loor, G., et al. Menadione triggers cell death through ROS-dependent mechanisms involving PARP activation without requiring apoptosis. Free Radical Biology and Medicine. 49 (12), 1925-1936 (2010).
- Esposito, S., et al. Redox-sensitive GFP to monitor oxidative stress in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 28 (2), 133-144 (2017).
- Meyer, A. J., et al. Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor for the redox potential of the cellular glutathione redox buffer. Plant Journal. 52 (5), 973-986 (2007).
- Galvan, D. L., et al. Real-time in vivo mitochondrial redox assessment confirms enhanced mitochondrial reactive oxygen species in diabetic nephropathy. Kidney International. 92 (5), 1282-1287 (2017).
- Swain, L., Nanadikar, M. S., Borowik, S., Zieseniss, A., Katschinski, D. M. Transgenic organisms meet redox bioimaging: One step closer to physiology. Antioxidants and Redox Signaling. 29 (6), 603-612 (2018).
- Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Dey, S., Sidor, A., O’Rourke, B. Compartment-specific control of reactive oxygen species scavenging by antioxidant pathway enzymes. Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11185-11197 (2016).
