使用亚细胞室特异性红氧敏感绿色荧光蛋白评估细胞氧化
Summary
该协议描述了对细胞内亚细胞室特异性氧化还原状态的评估。对氧化还原敏感的荧光探针可在完整细胞中方便地进行比例分析。
Abstract
测量细胞内氧化/减少平衡提供了一个有机体的生理和/或病理性红氧状态的概述。硫醇对于通过降低二恶英和氧化二硫化物比来照亮细胞的氧化还原状态尤为重要。工程中含半胱氨酸的荧光蛋白为对氧化还原敏感的生物传感器开启了一个新时代。其中之一，对氧化还原敏感的绿色荧光蛋白（roGFP），可以很容易地引入具有腺病毒转导的细胞中，从而在不中断细胞过程的情况下评估亚细胞室的氧化还原状态。减少的半胱氨酸和氧化的囊肿的roGFP有激发最大值分别在488nm和405nm，发射在525nm。评估这些还原和氧化形式的比率，可以方便地计算细胞内的氧化平衡。在这种方法中，利用不朽的人类三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231）来评估活细胞内的红氧状态。协议步骤包括MDA-MB-231细胞线转导与腺病毒，以表达细胞状roGFP，治疗与H2O2，并评估半胱氨酸和半胱氨酸比与流动细胞学和荧光显微镜。
Introduction
1985年，赫尔穆特·西斯将氧化应激定义为”对前者的益氧化剂-抗氧化剂平衡的干扰“1，并进行了大量的研究，,以获得生物1、2、32的疾病、营养和衰老特异性氧化还原状态。13从那时起，对氧化应激的理解变得更加广泛。测试使用抗氧化剂对抗疾病和/或衰老的假设表明，氧化应激不仅造成伤害，而且在细胞中还有其他作用。此外，科学家已经表明，自由基在信号转导2中起着重要的作用。所有这些研究都加强了确定大分子还原氧化（氧化）比变化的重要性。酶活性、抗氧化剂和/或氧化剂以及氧化产物可以通过各种方法进行评估。其中，确定二醇氧化的方法可以说是最常用的方法，因为它们报告了细胞中的抗氧化剂和益氧化剂以及生物体4之间的平衡。具体来说，谷胱甘肽（GSH）/谷胱甘肽二硫化物（GSSG）和/或半胱氨酸（CyS）/半胱氨酸（CySS）之间的比率被用作生物标志物，用于监测生物体的氧化还原状态2。
用于测量益氧化剂和抗氧化剂之间的平衡的方法主要依赖于细胞内还原/氧化蛋白或小分子的水平。西方印迹和质谱法用于广泛评估还原/氧化大分子（蛋白质、脂质等）的比例，GSH/GSSG比率可以通过分光光度测定5来评估。这些方法的一个常见特征是细胞系统通过细胞系统化和/或组织均质化对系统的物理扰动。当需要测量不同细胞室的氧化状态时，这些分析也变得具有挑战性。所有这些扰动都会导致测定环境中的伪影。
对红氧敏感的荧光蛋白开启了一个有利的时代，用于评估氧化还原平衡，而不会在细胞6中引起干扰。它们可以针对不同的细胞内隔间，从而量化隔间特定活动（例如，检测线粒体和细胞溶酶的氧化还原状态），以调查细胞细胞器之间的串扰。黄色荧光蛋白（YFP）、绿色荧光蛋白（GFP）和HyPeR蛋白由Meyer及其同事6日审查。在这些蛋白质中，对氧化还原敏感的GFP（roGFP）是独一无二的，因为它的CyS（例如488nm/em.525nm）和CySS（例如405nm/525nm）的残留物不同，这允许比例分析，不像其他氧化还原敏感蛋白，如YFP77，8。8比例值输出是有价值的，因为它平衡了表达水平、检测敏感性和光漂白8之间的差异。细胞（细胞溶质、线粒体、细胞核）或不同生物体（细菌和哺乳动物细胞）的亚细胞隔间可以通过修改roGFP77、9、109,10来定位。
roGFP检测采用荧光成像技术进行，尤其是用于实时可视化实验。对于具有预定时间点的实验，也可以对roGFPs进行流细胞测量分析。本文描述了使用荧光显微镜和流细胞测定法，通过腺病毒转导对哺乳动物细胞中多表达的roGFP（针对细胞sol）的红氧状态进行比例评估。
Protocol
Representative Results
Discussion
生物体中的硫醇/二硫化物平衡反映了细胞的氧化还原状态。生物有谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋白质三醇和低分子量三醇，所有这些都受到氧化水平的影响，并呼应细胞的氧化状态4。工程性 roGfP 允许通过其 CyS 残留物7对硫醇/二硫化物平衡进行无中断定量。roGFP 的比值特性为哺乳动物细胞提供了可靠的氧化还原测量。roGFP可以很容易地引入细胞与转染方法和/或转导…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在西北大学弗赖伯格医学院和ViraQuest公司的实验室中，分别产生了用于细胞溶质性roGFP的构造和重组腺病毒。这项研究得到了宿主抗癌治疗研究中心的资助，授予P20GM109005，通过NIH国家生物医学研究所生物医学研究中心卓越（COBRE NIGMS），国家普通医学研究所系统药理学和毒理学培训计划赠款T32 GM106999， UAMS 基金会/医学研究捐赠奖 AWD00053956，UAMS 年终校长奖 AWD00053484。流细胞学核心设施部分由微生物发病和宿主炎症反应中心通过COBRE NIGMS授予P20GM103625支持。内容完全由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。ATA得到土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）2214-A奖学金的支持。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Sciences | 25200-056 | Cell culture |
| 4-well chamber slide | Thermo Scientific | 154526 | Cell seeding material for fluorescent imaging |
| 5 ml tubes with cell strainer cap | Falcon | 352235 | Single cell suspension tube for flow cytometry analysis |
| 6-well plate | Corning | 353046 | Cell seeding material for flow cytometry analysis |
| 15 ml conical tubes | MidSci | C15B | Cell culture |
| 75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks | Corning | 4306414 | Cell culture |
| Adenoviral cytosol specific roGFP | ViraQuest | VQAd roGFP | roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker |
| Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | Cell culture |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting |
| Countess cell counter chamber slides | Invitrogen | C10283 | Cell counting |
| DMEM | Gibco by Life Sciences | 11995-065 | Cell culture |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 20 µl | Fisherbrand | 02-717-161 | Cell culture |
| Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl | Fisherbrand | 02-717-166 | Cell culture |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses |
| Fluorescent Microscope | Advanced Microscopy Group (AMG) | Evos FL | Fluorescent imaging |
| Hydrogen Peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 | Positive control |
| Light Cube, Custom | Life Sciences | CUB0037 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm) |
| Light Cube, GFP | Thermo Scientific | AMEP4651 | Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm) |
| MDA-MB-231 | American Tissue Culture Collection | HTB-26 | Human epithelial breast cancer cell line |
| Microcentrifuge tubes, 2 ml | Grenier Bio-One | 623201 | Cell culture |
| PBS | Gibco by Life Sciences | 10010-023 | Cell culture |
| Pipet controller | Drummond | Hood Mate Model 360 | Cell culture |
| Serologycal pipet, 1 ml | Fisherbrand | 13-678-11B | Cell culture |
| Serologycal pipet, 5 ml | Fisherbrand | 13-678-11D | Cell culture |
| Serologycal pipet, 10 ml | Fisherbrand | 13-678-11E | Cell culture |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | HERACell 150i | CO2 incubator for cell culture |
| Trypan blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell counting |
References
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