Circadiane Entrainment van Drosophila Melanogaster

1. Vliegvoedselproductie Bereid per 1 L water vliegvoer bestaande uit 4,69 g gedroogde melasse, 19,70 g droge actieve gist, 87,22 g maïsmeel en 7,83 g agar. Combineer de hierboven genoemde inhoud in een crockpot en zet de warmte op 250 °F. Meng goed en ingrediënten worden toegevoegd. Houd het deksel op de crockpot als de vlieg voedsel wordt verwarmd, terwijl ook het mengen van de inhoud om de 10 minuten totdat het een rollende kook bereikt. Laat de rollende kook 20 minuten aanhouden voordat u het vuur uitzet. Voeg 83,60 mL water toe en houd het deksel van de crockpot eraf als het voedsel afkoelt. Meng en nota van de temperatuur van het voedsel om de 10 minuten met een glazen thermometer. Vermijd het laten van een laag van de film vestigen op de top van het voedsel. Zodra het voedsel is afgekoeld tot 60 °C, voeg 10,44 mL Tegosept en 5,51 mL propionzuur per liter water toegevoegd (zie stap 1.1). Meng goed en zet het vuur tot 60 °C om te voorkomen dat het voedsel te koel wordt. Pomp het vliegvoedsel indien nodig met behulp van de Droso-filler. Voor smalle flacons pomp je 10 mL en voor 6 oz vierkante bodem flessen pomp 60 mL. 2. Het verzamelen van vliegen van bepaalde leeftijd Monitorflessen van wilde typevliegen die gedurende 5-7 dagen bij 25 °C zijn opgeslagen totdat grote hoeveelheden pop (ongeveer 200 poppen) aan de zijkant van de fles zijn bevestigd. De gebruikte flessen zijn 6 oz Drosophila stock flessen met vierkante bodems. Maak bestaande volwassenen uit de fles. Ofwel tip de volwassenen in een nieuwe fles of plaats ze in 70% ethanol. Gebruik het doffe uiteinde van een #0 penseel om alle resterende volwassenen in het vliegvoedsel te duwen. Zorg ervoor dat u de verfborstel afvegen met 70% ethanol voor en na gebruik. Laat geruimde flessen 3 dagen zitten in een couveuse van 25 °C om de volgende generatie te laten afsluiten. Deze vliegen zullen tussen 0 en 3 dagen oud zijn. 3. Vliegscheiding Na 3 dagen, scheiden mannetjes van vrouwtjes en het verzamelen van het gewenste aantal voor elk geslacht voor elk van de vier tijdpunten. Vliegen kunnen worden onderscheiden door seks door genitaliën te onderzoeken; mannen hebben donkere afgeronde genitaliën, terwijl vrouwtjes lichtere, meer puntige genitaliën hebben. Vrouwtjes zijn ook veel groter dan mannelijke vliegen. Gebruik een CO2 anesthesie pad om effectief te scheiden van de vliegen en onderscheid te maken tussen de geslachten. Verplaats de vliegen met verfborstels om te voorkomen dat ze te doden. Verzamel 100 mannetjes en 100 vrouwtjes voor elk keer punt, met 50 mannetjes per flesje en 100 vrouwtjes per flesje. Mannen hebben de neiging om agressiever te zijn en hun sociale interacties leiden tot veel sterfgevallen wanneer er 100 individuen in een flesje. De vrouwtjes-tot 100 individuen- zijn onaangetast terwijl opgenomen in de flacon. Voer de collecties uit op de volgende tijdstippen: ZT1, ZT7, ZT13 en ZT19 (Tabel 1). Houd er rekening mee dat collecties in het donker (ZT12-ZT24) lichtgevoelig zijn, terwijl ZT0-ZT11-collecties worden uitgevoerd tijdens licht-op-tijden en kamerverlichting kan worden ingeschakeld. Houd er rekening mee dat twee afzonderlijke incubators worden gebruikt met omgekeerde lichtpatronen van 12 uur om alle collecties overdag en niet ‘s nachts te laten plaatsvinden. Gebruik overtollige vliegen om nieuwe flessen vliegen te maken voor toekomstige entrainment. Plaats 25 vrouwtjes met 5-7 mannetjes in elke nieuwe fles en plaats in de couveuse op 25 °C. 4. Vlieg incubatie Laat de vliegen te blijven in het licht geregeld incubators voor 3-5 dagen om circadiane entrainment te laten optreden. Zorg ervoor dat couveuses lichtdicht zijn, omdat zelfs kleine hoeveelheden lichtvervuiling de entrainment verstoren. 5. Immunofluorescentiefixatie Bereid na de entrainment nieuwe flacons van fixatieoplossing voor monsters die zullen worden gebruikt voor immunofluorescentie. Voeg voorafgaand aan het verwijderen van de vliegen uit de couveuse 4,8 mL van 4% formaldehyde verdund in 1x PBS + 0,1% Tween-20 toe aan elke nieuwe smalle flacon voor elke 100 vliegen die gefixeerd moeten worden. Elke flacon zal 100 mannelijke of 100 vrouwelijke Circadian entrained vliegen huisvesten. Plaats de smalle flesjes in ijs. 6. Immunofluorescentieverzameling Bij het verzamelen van de vliegen uit de couveuse voor immunofluorescentie, verwijder de dop van de fles en snel omkeren van de fles in de trechter. Tik de vliegen voorzichtig in de oplossing via de trechter om de vliegen in de flacon te begeleiden; combineren twee buizen van de 50 mannetjes voor een totaal van 100 mannetjes in een flesje en gebruik een enkele buis van 100 vrouwtjes voor de andere flacon. ZT13- en ZT19-collecties uitvoeren in het donker; gebruik maken van een rood licht om te zien als drosophila zijn veel minder gevoelig voor deze lichte golflengten en zijn daarom minder gevoelig voor lichtvervuiling13. Cryptochrome eiwit, in het bijzonder, is bijzonder gevoelig voor blauw licht, die moet worden vermeden14. Om de blootstelling aan licht te verminderen, zorg ervoor dat de ruimte van de collectie is lichtdicht met alle bronnen van licht geblokkeerd of bedekt. Wikkel deze flacons in folie zodat ZT13- en ZT19-vliegen niet worden blootgesteld aan licht wanneer ze in de volgende stap op de gekeerde mixer worden geplaatst. ZT1- en ZT7-vliegen zijn niet lichtgevoelig en kunnen zonder foliebekleding op de mixer worden geplaatst. 7. Nuterende mixer en opslag Nadat de vliegen zijn verzameld, tape de bovenkant van de flacons met fixatieve om morsen te voorkomen en plaats ze op de nutating mixer op 165 RPM bij 4 °C voor 4 uur. De vliegen zijn niet langer lichtgevoelig na deze fixatiestap, dus folie kan worden verwijderd om te controleren of de oplossing beweegt en vliegen worden ondergedompeld in het fixatiemiddel. Na het verwijderen van de vlieg met flesjes uit de gekneilde mixer verwijder de formaldehyde en was drie keer met 3.000 μL van 1x PBS, het omkeren van de flacon met elke wasbeurt. Bewaar de flacons met immunofluorescentiemonsters op 4 °C om toekomstige immunofluorescentie15te afwachten . 8. Inzameling voor eiwitextractie Bereid vier buizen van 50 mL en een Dewar met vloeibare stikstof voor het behoud van monsters voor eiwitextractie Voor het verzamelen van vliegen voor eiwit- of nucleïnezuurextractie, breng vliegen van de flessen naar de buis op dezelfde manier als in stap 6.1 en snel cap de buis om het vrijkomen van vliegen te voorkomen en plaats de buis in vloeibare stikstof te breken bevriezen. 9. Opslag voor eiwitextractie Bewaar snap bevroren monsters voor eiwitextractie bij -80 °C. Deze kunnen worden verwerkt volgens het eiwitextractieprotocol dat geschikt is voor downstream-analyse, inclusief immunoblotting16.