Her beskriver vi, hvordan man synkroniserer Drosophila til en døgnrytmen dag. Dette er det første og vigtigste skridt, der er nødvendigt for at studere biologiske rytmer og kronobiologi.
Næsten universel blandt organismer koordinerer døgnrytme biologisk aktivitet til Jordens bane omkring solen. For at identificere faktorer, der skaber denne rytme og forstå de deraf følgende output, er der behov for entraining af modelorganismer til definerede døgnrytmetidspunkter. Her beskriver vi en procedure for at oprede mange Drosophila til en defineret døgnrytme. Desuden beskriver vi post-entrainment skridt til at forberede prøver til immunfluorescens, nukleinsyre, eller protein ekstraktion-baseret analyse.
Næsten alle organismer på Jorden, fra den største ned til encellede, har en intern biologisk ur med en cyklus på omkring en dag. Dette er kendt som døgnrytmen (opfundet i 1953 af Franz Halberg fra latinske termer circa = om / ca og “dør” = dag)1. Selv om komponenter i kernen ur er kendt, og deres rudimentære mekanismer funktion konceptualiseret, er der stadig meget at forstå om, hvordan biologiske rytmer opretholdes i hele kroppen. Vigtigere er det, misregulering af biologiske rytmer er forbundet med dårlige sundhedsmæssige resultater, herunder dårlig hukommelse dannelse, søvnforstyrrelser, sæsonbestemt påvirke lidelse, depression, bipolar lidelse, diabetes, fedme, neurodegeneration, og kræft2,,3,4,5.
Drosophila er en veletableret model for undersøgelse af døgnrytmen biologi. Genetisk og biokemisk tractable, et stort antal er let entrained (som vil blive vist). Faktisk alle syv publikationer nævnt som centrale publikationer støtte i tildelingen af Nobelprisen for opdagelsen af døgnrytmen gearede disse styrker af Drosophila model6,7,88,9,10,11,12.
Derudover viser vi effektive strategier for indsamling af indtræmte fluer med henblik på enten immunfluorescens, nukleinsyre eller proteinekstraktionsbaseret analyse. Ved hjælp af disse strategier, kan man behandle og gemme større mængder af prøver til analyse i fremtiden. Disse metoder er meget fordelagtige, fordi de er reproducerbare og kan give hundredvis af inddannede fluer, der kan være en del af en stor datapulje.
Forskere udnytter denne medrivning protokol med succes og konsistens. Denne procedure gør det muligt at fikse en stor stikprøvepulje, der kan opbevares til fremtidig analyse. Derudover bevarer denne strategi de neurologiske mønstre, der er fremkaldt af indtrædelse til fremtidig undersøgelse.
Fiksering til opbevaring er en vigtig del af medredlingsprocessen, da det hjælper med at stabilisere hjernevæv, og det giver mulighed for mere tid til at analysere hver hjerne fra datapuljen og dermed minimere affald fra hjerner, der mister levedygtighed på grund afalder 21. Det vigtigste mål er at døgnrytmen entrain så mange fluer som muligt, således at der er løbende opgørelse til rådighed for hoveddissektioner og i sidste ende immunfluorescens eller protein ekstraktion til at observere resultaterne og afgøre, om resultaterne er af høj tillid. For at sikre, at døgnrytmen med indtrængning bevares ved fiksering, er det integreret, at enhver kilde til lysforurening elimineres. Fikseringen proces giver mulighed for Drosophila, der skal opbevares og samtidig bevare sin neurologiske “tidsstempel”, så de kan dissekeres senere og analyseres uden mærkbare forskelle til fluer, der er dissekeret og har gennemgået immunfluorescens umiddelbart efter medrivning. Med henblik på fiksering før immunfluorescens har laboratoriet med konsistens fastslået, at fluer er levedygtige i mindst op til 1 måned. Fikseringer for vestlig skamplet proteinekstraktion gør hjernen levedygtig på ubestemt tid, når de opbevares ved -80 °C.
Et andet kritisk protokoltrin er fluens sexing. Det er vigtigt, at dette trin gøres præcist som at have begge køn i samme hætteglas før fiksering kan føre til parring, som vil give nye fluer, der er af yngre alder og korrupte protein analyse, hvis hannerne ved et uheld undersøges i stedet for hunner eller vice versa. Derudover, når sexing er det vigtigt at fjerne larver prøver, der er til tider knyttet til hunner. Dette forhindrer udviklingen af nyt afkom inde i det kvindelige hætteglas, der potentielt kan ødelægge resultater.
Det næste trin i tilkundingsprotokollen kan være med elementer, der er relateret til dataanalyse. Fokus for protokollen er protein lokalisering, men hvis der er andre variabler, der er påvirket af døgnrytmen meduddannelse, skal de udforskes gennem nye veje, der ofte kræver protein eller nukleinsyre ekstraktion. Derudover er der andre proteiner i hjernen, der stadig kan analyseres via denne protokol. De eksperimenter, der er forbundet med protokollen analyseret visse proteiner, men listen over gener og proteiner, der spiller en rolle i døgnrytmen biologi er ikke blevet opbrugt. Protokollen er effektiv til at nå målet om at etablere en døgnrytme, men ansøgningerne er vidtrækkende.
The authors have nothing to disclose.
Særlig tak til University of Missouri-Kansas City og Jeffrey L. Price laboratorium.
100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |