果蝇黑色素的循环训练

1. 飞食品生产 每1升水，准备飞食包括4.69克干糖蜜，19.70克干活性酵母，87.22克玉米粉和7.83克阿加。 将上面列出的内容物组合在陶罐中，将热量加热到 250 °F。 混合好，添加成分。 当苍蝇食物加热时，请将锅盖放在陶罐上，同时每 10 分钟混合一次，直到煮沸。在关闭热量之前，让滚动煮沸继续 20 分钟。 加入 83.60 mL 的水，并在食物冷却时将陶罐盖关闭。 每 10 分钟用玻璃温度计混合并记录食物的温度。避免让一层薄膜沉淀在食物的上面。 一旦食物冷却到60°C，每每升添加一升水的Tegosept和5.51 mL的丙酸（见步骤1.1）。 混合好，加热到60°C，以防止食物变得太凉。 根据需要使用 Droso 填充器泵送飞食。 对于窄瓶，泵 10 mL 和 6 盎司方形底部瓶泵 60 mL。 2. 收集规定年龄的苍蝇 监测野生型苍蝇的瓶在25°C下储存5-7天，直到大量的幼蝇（约200只幼蝇）附着在瓶的侧面。使用的瓶子是6盎司的果蝇库存瓶与方形底部。 将现有成人从瓶子中清除。要么给成年人小费，或者用70%的乙醇装好。使用一个沉闷的#0画笔推动任何剩余的成年人进入苍蝇的食物。使用前和使用后，请务必用 70% 乙醇擦拭油漆刷。 允许清除的瓶子在 25°C 的培养箱中坐 3 天，以便下一代能够关闭。这些苍蝇将在0到3天大。 3. 飞行分离 3天后，将男性与女性分开，并收集四个时间点中每个性别的所需数字。苍蝇可以通过检查生殖器来区分性别;男性有深色圆润的生殖器，而女性有更轻，更尖的生殖器。雌性苍蝇也比雄蝇大得多。 使用CO2 麻醉垫有效地分离苍蝇，区分性别。用油漆刷移动苍蝇，以免杀死它们。 每个时间点收集 100 个男性和 100 个女性，每瓶 50 名男性和每瓶 100 女性。男性往往更咄咄逼人，当小瓶中有100个人时，他们的社交互动会导致大量死亡。女性多达100人-不受影响，而包含在小瓶。 在以下时间点执行集合：ZT1、ZT7、ZT13 和 ZT19（表 1）。请注意，在黑暗中完成的集合 （ZT12-ZT24） 对光敏感，而 ZT0-ZT11 集合在开灯时完成，房间灯可以亮起。请注意，两个独立的孵化器采用逆反 12 小时光模式，允许所有收集在白天进行，而不是一夜之间发生。 使用多余的苍蝇创造新的苍蝇瓶，为未来的训练。将25个雌性与5-7名男性放在每个新瓶子中，并在25°C的培养箱中放置。 4. 飞孵化 允许苍蝇在受光调节的培养箱中停留3-5天，以允许昼夜感染发生。确保孵化器是光紧的，因为即使是少量的光污染也会干扰约束。 5. 免疫荧光固定 在灌制后，为用于免疫荧光的样品准备新的固定溶液瓶。在从培养箱中取出苍蝇之前，每100只要固定一只苍蝇，将稀释在1x PBS中稀释的4.8 mL的4%甲醛=0.1%Tween-20添加到每100只新的窄瓶中。每个小瓶将房子100雄蝇或100只雌性Circadian被训练苍蝇。将狭窄的小瓶放在冰中。 6. 免疫荧光收集 从培养箱中收集苍蝇进行免疫荧光时，取出瓶盖并快速将瓶子倒入漏斗中。通过漏斗轻轻将苍蝇点击到溶液中，帮助引导苍蝇进入小瓶;将50个雄性的两个管子组合在一个小瓶中，总共100个雄性，用一根100雌性的单管为另一个小瓶。 在黑暗中执行 ZT13 和 ZT19 集合;使用红灯，以看到嗜血杆菌是不太敏感，这些光波长，因此不太容易受到光污染13。特别是隐色素蛋白，对蓝光特别敏感，必须避免14。 为了减少光线照射，请确保收集室光线紧，任何光源都阻挡或遮盖。将这些小瓶包裹在铝箔中，以便 ZT13 和 ZT19 苍蝇在以下步骤中放置在螺母混合器上时不会暴露在光线下。ZT1 和 ZT7 苍蝇不对光敏感，可以放置在混合器上，无需箔覆盖。 7. 螺母混合器和存储 收集苍蝇后，将装有固定性物质的小瓶顶部胶带固定，以避免溢出，并在 4°C 时以 165 RPM 的转速将苍蝇放在螺母搅拌机上 4 小时。苍蝇在此固定步骤后不再对光敏感，因此可能会移除铝箔以验证溶液是否移动，并且苍蝇正在浸入固定器中。 从坚果搅拌机中去除含有小瓶的飞后，取出甲醛，用 3，000 μL 的 1x PBS 洗涤三次，每次洗涤后将小瓶反转。 将带有免疫荧光样品的小瓶储存在4°C，等待未来的免疫荧光15。 8. 蛋白质提取的收集 准备四个 50 mL 管和一个含有液氮的 Dewar，用于保存蛋白质提取样品 对于收集苍蝇的蛋白质或核酸提取，转移苍蝇从瓶子到管的方式与步骤6.1相同，并迅速封顶管，以防止苍蝇释放，并入液氮卡冻结。 9. 蛋白质提取储存 将捕捉冷冻样品储存在-80°C下进行蛋白质提取。 这些可以根据适合下游分析的蛋白质提取方案进行处理，包括免疫印迹16。