In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

De neocortex is het buitenste blad van de zoogdiercerebrum en de zetel van hogere cognitieve functies^1,2,3,4,5. Om een acute genetische manipulatie in de zoogdiernetrocortex in vivo te bereiken tijdens de embryonale ontwikkeling, zijn twee verschillende methoden onderzocht: virale infectie⁶ en in utero elektroporatie⁷. Beide methoden maken efficiënte targeting van neocorticale cellen mogelijk, maar hebben last van enkele beperkingen. Het grote voordeel van in utero elektroporatie in vergelijking met virale infectie is het vermogen om ruimtelijke specificiteit te bereiken binnen de neocortex, die wordt bereikt door het reguleren van de richting van het elektrische veld.

Sinds elektroporatie voor het eerst werd aangetoond dat het de binnenkomst van DNA in de cellen in vitro⁸vergemakkelijkt, is het toegepast om DNA te leveren in verschillende gewervelde dieren in vivo. In de ontwikkelingsneurowetenschappen werd in utero-elektroporatie van de muis neocortex voor het eerst gemeld in 2001^9,10. Deze methode bestaat uit een injectie van het DNA-mengsel in de laterale ventrikel van de embryonale hersenen en de daaropvolgende toepassing van het elektrische veld met behulp van pincet-elektroden, die ruimtelijke precisie^7,11mogelijk maakt . In utero elektroporatie is sindsdien toegepast om nucleïnezuren te leveren om de expressie van endogene of ectopisch toegevoegde genen in de muis neocortex te manipuleren. Belangrijke vooruitgang is onlangs geboekt door de toepassing van de methodologie van CRISPR/ Cas9-gemedieerde genoombewerking via in utero elektroporatie in de muis neocortex uit te voeren (1) genverstoring in postmitotische neuronen^12,,13 en neurale voorloper cellen¹⁴, en (2) genoom¹⁵ en epigenome¹⁶ bewerken.

Zeer snel na het eerste rapport in de muis, in utero elektroporatie werd toegepast op de embryonale rat neocortex^17,18. Niet-knaagdieren bleven een uitdaging tot de eerste in utero elektroporatie van fretten, een kleine carnivoor, werd gemeld in 2012^19,20. Sindsdien is in utero elektroporatie van fretten toegepast om de mechanismen van neocortexontwikkeling te bestuderen door neurale voorlopers en neuronen^20,21 ,^22,2223,te manipuleren, waarbij de expressie van endogene genen wordt gemanipuleerd, inclusief het gebruik van CRISPR/Cas9-technologie²⁴, en door ectopische genen te leveren^21,22,25, inclusief mensspecifieke genen²⁶. Bovendien is in utero-elektroporatie van fretten gebruikt om kenmerken van de ontwikkeling van menselijke neocortex in pathologische omstandigheden^27,28aan te pakken .

In de context van de ontwikkeling van neocortex zijn de voordelen van het gebruik van fretten als modelorganisme ten opzichte van muizen te wijten aan het feit dat fretten een reeks menselijke kenmerken beter samenvatten. Op anatomisch niveau vertonen fretten een karakteristiek patroon van corticale vouwen, dat ook aanwezig is in menselijke en meeste andere primaten, maar volledig afwezig is bij muizen of ratten^4,29,30,31. Op histologisch niveau hebben fretten twee verschillende subventriculaire kiminale zones, aangeduid als de binnenste en buitenste subventriculaire zones (respectievelijk ISVZ en OSVZ)^32,33, gescheiden door de binnenste vezellaag²³. Deze functies worden ook gedeeld met primaten, waaronder mensen, maar niet met muizen^34. De ISVZ en OSVZ in fretten en mensen zijn bevolkt met overvloedige neurale voorlopercellen, terwijl de subventriculaire zone (SVZ) van muizen bevat slechts schaarse neurale voorlopers^21,32,35,36. Op cellulair niveau vertonen fretten een groot deel van een subtype neurale voorlopers die respectievelijk basale of buitenste radialeglia (bRG of oRG) worden genoemd, die als instrumenteel worden beschouwd voor de evolutionaire expansie van de zoogdiernecitator^34,37,38. bRG zijn dus zeer overvloedig in de foetale menselijke en embryonale fret neocortex, maar ze zijn zeer zeldzaam in de embryonale muis neocortex^35,36. Bovendien vertoont ferret bRG morfologische heterogeniteit vergelijkbaar met die van de menselijke bRG, veel beter dan muis bRG²¹. Ten slotte vertoont de ontwikkeling van fret neocortex op moleculair niveau genexpressiepatronen die sterk lijken op die van foetale menselijke neocortex, waarvan wordt aangenomen dat ze de ontwikkeling van corticale vouwen controleren, onder andere³⁹.

De cel biologische en moleculaire kenmerken van fret bRG maken ze zeer proliferative, vergelijkbaar met de menselijke bRG. Dit resulteert in een verhoogde productie van neuronen en de ontwikkeling van een uitgebreide en zeer complexe neocortex³⁴. Deze kenmerken maken fretten uitstekend model organismen voor het bestuderen van mens-achtige kenmerken van neocortex ontwikkeling die niet kunnen worden gemodelleerd in muizen^26,40. Om optimaal gebruik te maken van de fret als modelorganisme werd de gepresenteerde methode ontwikkeld. Het bestaat uit in utero elektroporatie van E33 fret embryo’s met een plasmide uitdrukken GFP (pGFP) onder de controle van een alomtegenwoordige promotor, CAG. De geëlektreerde embryo’s kunnen vervolgens embryonaal of postnatally worden geanalyseerd. Om het aantal geofferde dieren te verminderen, worden vrouwelijke fretten (jills) gesteriliseerd door hysterectomie en gedoneerd voor adoptie als huisdier. Als de beoogde embryo’s in embryonale stadia worden geoogst, wordt een tweede operatie uitgevoerd en worden de embryo’s verwijderd door een keizersnede, terwijl de jills hysterectomized zijn. Als de beoogde embryo’s worden geanalyseerd in postnatale stadia, worden de jills hysterectomized nadat de pups zijn gespeend of geofferd. Daarom wordt ook een protocol gepresenteerd voor de hysterectomie van jills.