في فيتفو استهداف الخلايا السلف العصبية في النمس نيوكورتكس من قبل في الكهربائية الرحمية
Summary
هنا هو بروتوكول لأداء التلاعب الجيني في الدماغ النمس الجنيني باستخدام في كهربائي الرحم. هذه الطريقة تسمح لاستهداف الخلايا السلف العصبي في القشرة العصبية في الجسم الحي.
Abstract
التلاعب في التعبير الجيني في الجسم الحي أثناء التطور الجنيني هو الطريقة المفضلة عند تحليل دور الجينات الفردية أثناء تطور الثدييات. في كهربائي الرحم هو تقنية رئيسية لتلاعب التعبير الجيني في الدماغ الثديي الجنيني في الجسم الحي. يتم تقديم بروتوكول لكهربية الرحم من القشرة الجديدة الجنينية من النمس، آكلة اللحوم الصغيرة، هنا. يتم استخدام النمس بشكل متزايد كنموذج لتطوير القشرة الجديدة ، لأن القشرة الجديدة يعرض سلسلة من الميزات التشريحية والهلوسية والخلوية والجزيئية الموجودة أيضًا في الرئيسيات البشرية وغير البشرية ، ولكنها غائبة في نماذج القوارض ، مثل الفئران أو الفئران. في الرحم الكهربائي تم تنفيذها في يوم الجنين (E) 33، مرحلة منتصف النشأة في النمس. في الإلكتروبور الرحمي يستهدف الخلايا السلف العصبية بطانة البطينين الجانبي للدماغ. أثناء تكوين الخلايا العصبية، هذه الخلايا السلف تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا العصبية الأخرى. يُظهر هذا العمل النتائج والتحليلات التمثيلية في E37، ويوم ما بعد الولادة (P) 1، و P16، بما يعادل 4 و9 و24 يوماً بعد الحمل الكهربائي الرحمي، على التوالي. في المراحل السابقة، وذرية الخلايا المستهدفة يتكون أساسا من مختلف الأنواع الفرعية السلف العصبي، في حين أن في المراحل اللاحقة معظم الخلايا المسماة هي الخلايا العصبية ما بعد التورم. وهكذا، في كهربائي الرحم تمكن من دراسة تأثير التلاعب الجيني على السمات الخلوية والجزيئية لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية. من خلال تأثيره على مجموعات الخلايا المختلفة، في القطب الرحمي يمكن أيضا أن تستخدم للتلاعب في الخصائص النسيجية والتشريحية من النمس القشرة الجديدة. الأهم من ذلك ، كل هذه الآثار حادة ويتم تنفيذها مع خصوصية اصمية يحددها المستخدم.
Introduction
القشرة الجديدة هي الورقة الخارجية للدماغ النخاعي الثديي ومقعد الوظائف المعرفية العليا1,2,3,4,5. من أجل تحقيق تلاعب وراثي حاد في القشرة الثديية في الجسم الحي خلال التطور الجنيني ، تم استكشاف طريقتين مختلفتين: العدوى الفيروسية6 وفي الإلكتروبورات الرحمية7. كلتا الطريقتين تسمحان باستهداف الخلايا القشرية الجديدة بكفاءة ولكنها تعاني من بعض القيود. الميزة الرئيسية في الإلكتروبورات الرحمية مقارنة بالعدوى الفيروسية هي القدرة على تحقيق خصوصية المكان داخل القشرة الجديدة ، والتي تتحقق من خلال تنظيم اتجاه المجال الكهربائي.
منذ أن تبين لأول مرة الكهربائي لتسهيل دخول الحمض النووي إلى الخلايا في المختبر8، فقد تم تطبيقه على تسليم الحمض النووي إلى مختلف الفقاريات في الجسم الحي. في علم الأعصاب التنموي، في كهربائي الرحم من الماوس نيوكورتيكس ذكرت لأول مرة في 20019،10. هذه الطريقة تتكون من حقن خليط الحمض النووي في البطين الجانبي للدماغ الجنيني وتطبيق لاحق من المجال الكهربائي باستخدام أقطاب الملاقط، والذي يسمح الدقة المكانية7،11. في الرحم الكهربائي ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها لتقديم الأحماض النووية من أجل التعامل مع التعبير عن الجينات الذاتية أو مُضافة خارج الرحم في الماوس نيوكورتيكس. وقد أحرز تقدم هام في الآونة الأخيرة من خلال تطبيق منهجية تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 بوساطة عبر في الإلكتروبور في الفيرريكتيكس الماوس لأداء (1) اضطراب الجينات في الخلايا العصبية ما بعد الديمومتوية12,13 والخلايا السلف العصبي14, و (2) الجينوم15 و epigenome16 التحرير.
بعد وقت قصير جدا من التقرير الأول في الماوس، في كهربائي الرحم تم تطبيقها على الجرثان الجنينية17،18. ظلت غير القوارض تحديا حتى الأول في كهربائي الرحم من النمس, آكلة اللحوم الصغيرة, وذكرت في 201219,20. ومنذ ذلك الحين، في الكهربائي الرحمي من النمس وقد طبقت لدراسة آليات تطوير القشرة الجديدة من خلال وضع العلامات على السلف العصبية والخلايا العصبية20،21،22،23، التلاعب في التعبير عن الجينات الذاتية ، بما في ذلك استخدام CRISPR / Cas9 التكنولوجيا24، وتقديم الجينات خارج الرحم21،22،25، بما في ذلك الجينات البشريةالمحددة 26. وعلاوة على ذلك، في كهربائي الرحم من النمس وقد استخدمت لمعالجة ملامح التنمية في القشرة البشرية في الظروف المرضية27،28.
في سياق تطور القشرة الجديدة ، تعود مزايا استخدام النمس ككائن حي نموذجي مقارنة بالفئران إلى حقيقة أن النمس تُلخي بشكل أفضل سلسلة من الميزات الشبيهة بالبشر. على المستوى التشريحي، تظهر النمس نمطاً مميزًا للطي القشري، والذي هو موجود أيضًا في الإنسان ومعظم الرئيسيات الأخرى، ولكنه غائب تمامًا في الفئران أو الفئران4،29،30،31. على مستوى النسيج النمس اثنين من مناطق فرعية فرعية متميزة، ويشار إلى المناطق الفرعية البطينية الداخلية والخارجية (ISVZ وOSVZ، على التوالي)32،33، مفصولة طبقة الألياف الداخلية23. يتم أيضا تقاسم هذه الميزات مع الرئيسيات، بما في ذلك البشر، ولكن ليس مع الفئران34. وSSVZ وOSVZ في النمس والبشر هي المأهولة مع خلايا السلف العصبية وفيرة، في حين أن المنطقة دون البطينية (SVZ) من الفئران تحتوي فقط على السلف العصبية21،32،35،36. على المستوى الخلوي، تظهر النمس نسبة عالية من نوع فرعي من السلف العصبية المشار إليها باسم glia القاعدية أو الخارجية شعاعي (bRG أو oRG، على التوالي)، والتي تعتبر مفيدة للتوسع التطوري للcorcortex الثدييات34،37،38. bRG وبالتالي وفيرة للغاية في الجنينية النمس النمس النضر ، لكنها نادرة جدا في الماوس الجنيني35،36. وعلاوة على ذلك، يظهر bRG النمس التجانس المورفولوجية مماثلة لتلك التي من bRG الإنسان، متفوقة بكثير على الماوس bRG21. وأخيرا، على المستوى الجزيئي، وتطوير النمس القشرة الجديدة يظهر أنماط التعبير الجيني مشابهة جدا لتلك التي من العصر الجديد الإنسان الجنيني، والتي يفترض أن السيطرة على تطوير للطي القشرية، من بين أمور أخرى39.
الخصائص البيولوجية والجزيئية الخلية من bRG النمس جعلها تكاثرية للغاية، على غرار bRG الإنسان. وهذا يؤدي إلى زيادة إنتاج الخلايا العصبية وتطوير34neocortex موسعة ومعقدة للغاية . هذه الخصائص تجعل النمس كائنات نموذجية ممتازة لدراسة السمات الشبيهة بالبشر من التنمية القشرة الجديدة التي لا يمكن نمذجة في الفئران26،40. للاستفادة الكاملة من النمس ككائن حي نموذجي تم تطوير الطريقة المقدمة. وهو يتألف من كهربائي الرحم من الأجنة النمس E33 مع plasmid التعبير عن GFP (pGFP) تحت سيطرة المروج في كل مكان، CAG. ويمكن بعد ذلك تحليل الأجنة الكهربائية الجنينية أو بعد الولادة. من أجل تقليل عدد الحيوانات التي تم التضحية بها ، يتم تعقيم النمس الإناث (جيلس) عن طريق استئصال الرحم ويتم التبرع بها لاعتمادها كحيوانات أليفة. إذا تم حصاد الأجنة المستهدفة في مراحل جنينية ، يتم إجراء عملية جراحية ثانية وإزالة الأجنة عن طريق عملية قيصرية ، في حين أن الجيل يتم استئصال الرحم. إذا تم تحليل الأجنة المستهدفة في مراحل ما بعد الولادة ، يتم استئصال الجيل بعد فتومة الجراء أو التضحية بها. وبالتالي ، يتم تقديم بروتوكول لاستئصال الرحم من جيلس أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في كهربائي الرحم في النمس هو تقنية هامة، مع مزايا وعيوب فيما يتعلق بطرق أخرى. هناك خطوات حاسمة والقيود على هذا الأسلوب، فضلا عن التعديلات المحتملة والتطبيقات المستقبلية أن نضع في اعتبارنا.
منذ العمل الرائد من فيكتور بوريل وزملاؤه على التلاعب الجيني من النمس النمس بعد الولا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لخدمات ومرافق معهد ماكس بلانك لبيولوجيا الخلايا الجزيئية وعلم الوراثة على الدعم المتميز المقدم ، ولا سيما الفريق بأكمله من الخدمات الطبية الحيوية (BMS) لتربية ممتازة من النمس وJ. Peychl وفريقه من مرفق المجهر الخفيفة. ونحن ممتنون بشكل خاص لكرينت ريبي وآنا فايفر من إدارة المباني للدعم البيطري الاستثنائي ولي شينغ من مجموعة هوتنر للمساعدة في العمليات الجراحية النمس.
Materials
| 1ml syringe | BD | 309628 | Electroporation |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V392ZG | Surgery |
| Aluminium spray | cp-pharma | 98017 | Surgery |
| Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU) | WDT | 6301 | Surgery |
| Cappilary holder | WPI | MPH6S12 | Electroporation |
| Dexpanthenol Ointment solution | Bayer | 6029009.00.00 | Surgery |
| Drape sheet 45x75cm | Hartmann | 2513052 | Surgery |
| Electrode Tweezer, platinum plated 5mm | BTX | 45-0489 | Electroporation |
| Electroporator | BTX | ECM830 | Electroporation |
| Fast Green | Sigma | F7258-25G | Electroporation |
| Ferret Mustela putorius furo | Marshall | NA | Experimental organism |
| Fiber optic light source | Olympus | KL1500LCD | Electroporation |
| Forceps | Allgaier instrumente | 08-033-130 | Surgery |
| Forceps 3C-SA | Rubis Tech | 3C-SA | Surgery |
| Forceps 55 | Dumostar | 11295-51 | Surgery |
| Forceps 5-SA | Rubis Tech | 5-SA | Surgery |
| Gauze swabs large | Hartmann | 401723 | Surgery |
| Gauze swabs small | Hartmann | 401721 | Surgery |
| GFAP antibody | Dako | Z0334 | Antibody |
| GFP antibody | Aves labs | GFP1020 | Antibody |
| Glass cappilaries (Borosilicate glass with filament, OD:1.2mm, ID: 0.69mm, 10cm length) | Sutter Instrument | BF120-69-10 | Electroporation |
| Glucose | Bela-pharm | K4011-02 | Surgery |
| Heat pad | Hans Dinslage | Sanitas SHK18 | Surgery |
| Iodine (Betadine solution 100 mg/ml) | Meda | 997437 | Surgery |
| Isofluran | CP | 21311 | Surgery |
| Loading tips 20µl | Eppendorf | #5242 956.003 | Electroporation |
| Metamizol | WDT | 99012 | Surgery |
| Metzenbaum dissecting scissors | Aesculap | BC600R | Surgery |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-97 | Electroporation |
| pCAGGS-GFP | NA | NA | From Kalebic et al., eLife, 2018 |
| PCNA antibody | Millipore | CBL407 | Antibody |
| pH3 antibody | Abcam | ab10543 | Antibody |
| Scalpel | Aesculap | 294200104 | Surgery |
| Shaver | Braun | EP100 | Surgery |
| Sox2 antibody | R+D Systems | AF2018 | Antibody |
| Surgical clamp 13cm | WDT | 27080 | Surgery |
| Surgical double spoon (Williger) | WDT | 27232 | Surgery |
| Surgical drape | WDT | 28800 | Surgery |
| Surgical scissors small | FST | 14090-09 | Surgery |
| Suturing needle holder | Aesculap | BM149R | Surgery |
| Tbr2 antibody | Abcam | ab23345 | Antibody |
| Transfer pipette 3ml | Fischer scientific | 13439108 | Surgery |
| Water bath | Julabo | TW2 | Surgery |
References
- Kalebic, N., Long, K., Huttner, W. B., Kaas, J. . Evolution of Nervous Systems 2e. 3, 73-89 (2017).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neurosciences. 10 (10), 724-735 (2009).
- Dehay, C., Kennedy, H., Kosik, K. S. The outer subventricular zone and primate-specific cortical complexification. Neuron. 85 (4), 683-694 (2015).
- Fernandez, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Molnar, Z., et al. New insights into the development of the human cerebral cortex. Journal of Anatomy. 235 (3), 432-451 (2019).
- Janson, C. G., McPhee, S. W., Leone, P., Freese, A., During, M. J. Viral-based gene transfer to the mammalian CNS for functional genomic studies. Trends in Neurosciences. 24 (12), 706-712 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Development Growth & Differentiation. 50 (6), 507-511 (2008).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. 发育生物学. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. 神经科学. 103 (4), 865-872 (2001).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e239 (2007).
- Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
- Shinmyo, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the mouse brain using in utero electroporation. Science Reports. 6, 20611 (2016).
- Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Albert, M., et al. Epigenome profiling and editing of neocortical progenitor cells during development. EMBO Journal. 36 (17), 2642-2658 (2017).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-162 (2002).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. Journal of Visualized Experiments. (6), e236 (2007).
- Kawasaki, H., Iwai, L., Tanno, K. Rapid and efficient genetic manipulation of gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Molecular Brain. 5, 24 (2012).
- Kawasaki, H., Toda, T., Tanno, K. In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation. Biology Open. 2 (1), 95-100 (2013).
- Kalebic, N., et al. Neocortical expansion due to increased proliferation of basal progenitors is linked to changes in their morphology. Cell Stem Cell. 24 (4), 535-550 (2019).
- Martinez-Martinez, M. A., et al. A restricted period for formation of outer subventricular zone defined by Cdh1 and Trnp1 levels. Nature Communication. 7, 11812 (2016).
- Saito, K., et al. Characterization of the Inner and Outer Fiber Layers in the Developing Cerebral Cortex of Gyrencephalic Ferrets. Cerebral Cortex. 29 (10), 4303-4311 (2019).
- Shinmyo, Y., et al. Folding of the Cerebral Cortex Requires Cdk5 in Upper-Layer Neurons in Gyrencephalic Mammals. Cell Reports. 20 (9), 2131-2143 (2017).
- Matsumoto, N., Shinmyo, Y., Ichikawa, Y., Kawasaki, H. Gyrification of the cerebral cortex requires FGF signaling in the mammalian brain. Elife. 6, 29285 (2017).
- Kalebic, N., et al. Human-specific ARHGAP11B induces hallmarks of neocortical expansion in developing ferret neocortex. Elife. 7, 41241 (2018).
- Masuda, K., et al. Pathophysiological analyses of cortical malformation using gyrencephalic mammals. Science Reports. 5, 15370 (2015).
- Matsumoto, N., et al. Pathophysiological analyses of periventricular nodular heterotopia using gyrencephalic mammals. Human Molecular Genetics. 26 (6), 1173-1181 (2017).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of brain development in the ferret via MRI. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex in the ferret. I. Description of the external changes. Journal of Anatomy. 146, 141-152 (1986).
- Sawada, K., Watanabe, M. Development of cerebral sulci and gyri in ferrets (Mustela putorius). Congenital Anomalies (Kyoto). 52 (3), 168-175 (2012).
- Reillo, I., Borrell, V. Germinal zones in the developing cerebral cortex of ferret: ontogeny, cell cycle kinetics, and diversity of progenitors. Cerebral Cortex. 22 (9), 2039-2054 (2012).
- Smart, I. H., McSherry, G. M. Gyrus formation in the cerebral cortex of the ferret. II. Description of the internal histological changes. Journal of Anatomy. 147, 27-43 (1986).
- Borrell, V., Reillo, I. Emerging roles of neural stem cells in cerebral cortex development and evolution. Developmental Neurobiology. 72 (7), 955-971 (2012).
- Reillo, I., de Juan Romero, C., Garcia-Cabezas, M. A., Borrell, V. A role for intermediate radial glia in the tangential expansion of the mammalian cerebral cortex. Cerebral Cortex. 21 (7), 1674-1694 (2011).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nature Neurosciences. 13 (6), 690-699 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Fietz, S. A., Huttner, W. B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective. Current Opinion in Neurobiology. 21 (1), 23-35 (2011).
- De Juan Romero, C., Bruder, C., Tomasello, U., Sanz-Anquela, J. M., Borrell, V. Discrete domains of gene expression in germinal layers distinguish the development of gyrencephaly. EMBO Journal. 34 (14), 1859-1874 (2015).
- Kawasaki, H. Molecular investigations of the brain of higher mammals using gyrencephalic carnivore ferrets. Neurosciences Research. 86, 59-65 (2014).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Borrell, V. In vivo gene delivery to the postnatal ferret cerebral cortex by DNA electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 186 (2), 186-195 (2010).
- Borrell, V., Kaspar, B. K., Gage, F. H., Callaway, E. M. In vivo evidence for radial migration of neurons by long-distance somal translocation in the developing ferret visual cortex. Cerebral Cortex. 16 (11), 1571-1583 (2006).
- Johnson, M. B., et al. Aspm knockout ferret reveals an evolutionary mechanism governing cerebral cortical size. Nature. 556 (7701), 370-375 (2018).
- Vaid, S., et al. A novel population of Hopx-dependent basal radial glial cells in the developing mouse neocortex. Development. 145 (20), 169276 (2018).
- Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nature Communications. 4, 2125 (2013).
