החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

1. תכנון ובניית פלסמידי ביטוי CRISPR/Cas9n-sgRNA חפש רצפי מדריך של 20 bp ישירות במעלה הזרם של כל 5′-NGG ליד האתר לשינוי. יש צורך בזוג רנ”א חד-מנחה (sgRNAs) כאשר נעשה שימוש בניקאז Cas9 (Cas9n) מסטרפטוקוקוס פיוגנס . זוג ה-sgRNAs חייבים להיות מסוגלים לייצר 5′ overhangs עם ניקינג עם היסט של -4 עד 20 bp6. סדר אוליגוס הכרחי ו pSpCas9n-2A-puro וקטור. שכפל sgRNA לתוך וקטור pSpCas9n לביטוי משותף עם Cas9n בעקבות פרוטוקולשפורסם 12. 2. תכנון ובניית וקטור מיקוד מבוסס piggyBac הורד את רצף גני היעד וחפש אתר TTAA ליד האתר לשינוי.הערה: המרחק בין אתר TTAA לבין האתר המיועד לשינוי צריך להיות קטן ככל האפשר. אם בתוך רצף קידוד ואין אתר TTAA קיים במרחק של 100 bp, יש צורך להציג אחד על ידי ביצוע תחליפי נוקלאוטידים נרדפים. תכננו זרועות הומולוגיות (HAs) ושלבו מוטציות נקודתיות רצויות ב-HAs. האורך האופטימלי של HAs צריך להיות סביב 500 – 1200 bp.הערה: מומלץ להכניס תחליפי נוקלאוטידים נרדפים כדי לבצע מוטציה ברצף PAM על מנת למנוע ביקוע מחדש פוטנציאלי של Cas9n. בנה את וקטור המיקוד הסופי בהתאם לפרוטוקול10 שנקבע.הערה: בווקטור המיקוד המשמש כאן, קלטת בחירה של מקדם PGK המונעת על ידי puro-deltaTK מוקפת בחזרות הפוכות טרנספוזון. 3. עריכה גנטית של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על משטחים רקומביננטיים מצופים למינין 521 (5 מיקרוגרם/מ”ל) ב-mTeSR1 בינוני13. התאים אמורים להגיע למפגש של 70-85% לאחר 72 שעות לאחר יחס פיצול של 1:3.הערה: אם הם קיימים, הסר תאים שהתמייננו באופן ספונטני לפני שינוי בינוני יומיומי על-ידי שאיפתם בעדינות. ביום ההעברה, צפו מספיק בארות של צלחת 24 בארות עם 300 μL של תמיסת laminin 521 (5 מיקרוגרם / מ”ל) ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפחות. הסר את תמיסת הציפוי בעדינות והוסף 300 μL של מדיום mTeSR1 טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 μM לכל באר, ולאחר מכן החזיר את הצלחת לאינקובטור כדי לקבל תאים.הערה: אין לאפשר לצלחות להתייבש בשום שלב בעת הסרת תמיסת ציפוי הלמינין. להעביר את hPSCs המניות מן האינקובטור, להסיר בינוני בילה, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת באמצעות 1 מ”ל של סטרילי 1x DPBS. הוסיפו 1 מ”ל של מגיב דיסוציאציה עדינה של תאים לכל באר של צלחת 6 בארות ודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6-8 דקות כדי לנתק את התאים.הערה: הקש בעדינות על הצלחת ובדוק אם התאים יכולים להתנתק בקלות כדי להחליט אם העיכול ארוך מספיק. פיפטה עדינה למעלה ולמטה באמצעות קצה P1000 כדי להרים את כל ה-hPSCs. סיים את הדיסוציאציה על ידי הוספת 2 מ”ל של מדיום mTeSR1 טרי בתוספת מעכב ROCK של 10 μM (Y-27632) לתרחיף התא. מערבבים היטב ומעבירים את המתלה החד-תאי לצינור של 50 מ”ל, וצנטריפוגה בגודל 200 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט, והחזיר את התאים היטב במדיום mTeSR1 טרי של 2 מ”ל בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר. לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer. השתמש ב-Trypan Blue כדי להכתים ולהוציא תאים מתים. העבר 8 x 10 5 עד 1 x 106 תאים חיים לצינור1.5 מ”ל עבור כל תגובת נוקלאופקציה וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 3 דקות. ואז בזהירות לשאוף את supernatant. ערבבו 3 מיקרוגרם של פלסמידי הביטוי Cas9n-sgRNA הזוגיים ו-5 מיקרוגרם של פלסמיד וקטורי מיקוד ב-100 μL של תמיסת נוקלאוקציה מעורבת / תוסף מתוך ערכת הנוקלאופקציה של תאי גזע אנושיים. השתמש בפלסמיד בקרת GFP מהערכה והכן גם תערובת פלסמיד לבקרת GFP.הערה: חשוב להכין מקסי של כל הפלסמידים כדי להפחית את זיהום האנדוטוקסין לפני הנוקלאופקציה. ריכוז הפלסמידים צריך להיות בערך 1 מיקרוגרם / μL. השתמש בתערובת הדנ”א (נפח ~ 111 μL) כדי להשעות את התאים המוכנים ולהעביר אותו לקובט אלקטרופורציה (המסופק עם ערכת הנוקלאופקציה), תוך הימנעות מבועות. אלקטרופולציה של התאים באמצעות מכשיר הגרעין על ידי בחירת התנאים האופטימליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.הערה: אם משתמשים בערכת הגרעין לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בפעם הראשונה, יש צורך לבדוק את תוכנית האלקטרופורציה ולבחור את היעילה ביותר. יש להוסיף מיד 500 μL של צבע טרי וחם ל-37°C mTeSR1 בינוני בתוספת מעכב ROCK של 10 μM לתאים האלקטרופורטיביים. מעבירים את התערובת ל-2 בארות של צלחת בת 24 בארות שהוכנה משלבים 3.2 ו-3.3. החזירו במהירות את הצלחת לאינקובטור 37 °C / 5% CO2 ואפשרו לתאים להתאושש. 12-16 שעות מאוחר יותר, שנה את אמצעי תחזוקת התא. אם התאים יצרו קשר בין התא, משכו את מעכב ה-ROCK, אם לא, המשיכו להשלים את התווך עם המעכב. בין 24-48 שעות, בדוק את יעילות הגרעין על ידי בחינת ביטוי GFP בתאי הביקורת. תאים חיוביים GFP צריך להיות לפחות 30 אחוזים. 48 שעות לאחר הנוקלאופקציה, התחל לבחור תאים על ידי השלמת מדיום mTeSR1 עם 1 מיקרוגרם / מ”ל puromycin. 72 שעות לאחר נטילת נוקלאופקציה, יש להשלים את המדיום mTeSR1 עם 0.5 מיקרוגרם/מ”ל פורומיצין. אם מפגש התאים נמוך מ -30%, גם להשלים את המדיום עם מעכב 10 μM ROCK. 4-6 ימים לאחר הנוקלאופקציה, מעבירים את התאים העמידים לפורומיצין לצלחות של 10-15 x 96-באר בריכוז של 0.8 תאים/באר.הערה: חיוני להשלים את המדיום עם מעכב ROCK של 10 μM ו-0.5 מיקרוגרם/מ”ל פורומיצין. שמור על תאים אלה בטמפרטורה של 37 °C / 10% CO2 למשך 10-12 ימים כדי ליצור מושבות שמקורן בתאים בודדים. יש לטעון את המדיום פעם אחת 7 ימים לאחר הזריעה.הערה: רמת CO2 מוגברת מסייעת ל-hPSCs בודדים ליצור מושבות מניסיוננו. מסמנים בארות המכילות מושבה אחת ומחליפים את המדיום במדיום mTeSR1 טרי המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ”ל פורומיצין אך ללא מעכב ROCK.הערה: מנקודה זו ואילך, התאים יגדלו מתחת ל-37 °C/5% CO2. יומיים לאחר מכן, החליפו מדיום לבארות המכילות מושבות לא מובחנות. תוסף למדיום עם מעכב ROCK של 10 μM ו-0.5 מיקרוגרם/מ”ל פורומיצין.הערה: בבארות מסוימות, ייתכן שהתאים התמינו ויש להשליך אותם. השתמש בקצות פיפטה P2 כדי לגרד את המושבות בעדינות. מעבירים את תרחיף התאים שמקורו במושבה אחת ל-2 בארות חדשות על לוחות נפרדים של 96 בארות, ומשתמשים באחת לגנוטיפ ואחת לתחזוקה.הערה: חשוב לשמור בקפידה על המושבות ולשמור על רמת ההבחנה הספונטנית למינימום. הוציאו את הצלחת המכילה תאים לגנוטיפ ברגע שהמפגש ברוב הבארות הגיע ל-50% ומעלה. לזרוק את המדיום בילה ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS. Lyse התאים היטב באמצעות Bradley lysis buffer ולבודד דנ”א גנומי מכל באר בצלחת בעקבות פרוטוקול נלווה (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate). השתמש בשיטת PCR של צומת שלושה פריימרים כדי לבצע גנוטיפ של זרועות הומולוגיה שמאליות וימניות באופן עצמאי10.הערה: סכימה המציגה את שיטת ה-PCR מוצגת באיור 2. שלח את מוצרי ה- PCR של הצומת עבור שתי זרועות הומולוגיה מ 4-5 מושבות לריצוף סנגר וקבל את הרצפים.הערה: תוצאת הריצוף של 2 מושבות מבוססות מוצגת באיור 3A. שמור על מושבות עם הגנוטיפ הנכון והשלך את השאר. הרחיבו את המושבות הנכונות תחת בחירת פורומיצין רציפה והקפיאו אותן במעבר המוקדם ביותר האפשרי. 4. הסרת טרנספוזון מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ממוקדים שמור על מושבה אחת עם גנוטיפ נכון תחת 0.5 מיקרוגרם / מ”ל בחירת פורומיצין. Nucleofect 8 x 10 5 עד 1 x 106 תאים עם5 מיקרוגרם טרנספוזאז היפראקטיבי (pCMV-hyPBase) כמתואר לעיל (סעיף 3, שלבים 3.4-3.18). בצע גרעין בקרת GFP במקביל.הערה: יש להסיר את פורומיצין מהמדיום mTeSR1 מיד לאחר יצירת הגרעין של תאים אלה. לגדול ולסנן תאים עם קלטת הבחירה puro-deltaTK הוסרה בעקבות נהלים שפורסמו10.הערה: חשוב לעקוב בקפידה אחר ההליכים המקוריים. FIAU, או 1-(2-deoxy-2-fluoro-β-d-arabinofuranosyl)-5-יודוראציל), שימש כאנלוגיה של תימידין עבור הרפס סימפלקס מבוסס וירוס תימידין קינאז (HSV-tk). רצף את האזור שהשתנה כדי לאשר את הסרת הטרנספוזון.הערה: תוצאת הרצף של 3 מושבות מבוססות מוצגת באיור 3B. שמור על מושבות עם הגנוטיפ הנכון והתרחב לשימוש נוסף. לבצע אפיון של סמני פלוריפוטנטיות במושבות הנבחרות לפני השימוש בהם לניתוח נוסף.הערה: האפיון של שתי מושבות מבוססות מוצג באיור 4.