Червь выравнивания и Worm_CP, два трубопровода с открытым исходным кодом для выпрямления и количественной оценки флуоресценции изображения данных, полученных от Caenorhabditis elegans

Культивирование и визуализация C. elegans в соответствии с методом, описанным в этом протоколе, производит большие обзорные изображения популяций червей. Для облегчения визуального осмотра и классификации червей из этих изображений мы разработали Worm-выравнивание. Worm-align — это простой и удобный скрипт FIJI, который может быть использован для создания монтажей выпрямленных и выровненных червей. Черви выбираются из обзорных изображений, рисуя линию вдоль продольной оси червей. Каждому выбранного червя присваивается номер, обрезается и выпрямляется, и добавляется в монтаж. Монтажи могут быть сгенерированы на изображение или объединить все изображения из исходной папки ввода. Как и ожидалось, выход трубопровода во многом зависит от качества линий, нарисованных поверх изображений. Чтобы проиллюстрировать этот момент, рисунок 4 показывает несколько примеров строк и их выход из Worm-align. Полная линия от головы до кончика хвоста производит правильно выровненный червь (помеченный как “хороший”). На рисунке 4 также показано, как отслеживание неточностей во время выполнения червя-выравнивания влияет на выход выравнивания. Из аннотированного монтажа, включенного в рисунок 4C, следует позаботиться, чтобы избежать следующих ошибок, так как они препятствуют правильному выравниванию червей: Несогласованное отслеживание червя с головы до хвоста (с надписью “хвост к голове”). Это приводит к том, что черви ориентируются в разные стороны (т.е. голова к голове по сравнению с голова к хвосту) в выравнивании. Неполная трассировка (помечена как “неполная”). Это приводит только к части червя, который был прослежен, чтобы быть обрезаны для монтажа. Включение нескольких червей в один след (помеченный как “червь с двумя головами”). Это приводит к червей плюс (значительные разделы) их соседи вставляются в той же панели монтажа. Добавление случайных строк к изображению (помечено как «случайное»). Это приводит к вставке случайных панелей в монтаж. Для создания монтажа это не проблема, если две отдельные линии пересекаются (помечены как “пересекающиеся”) или соединены на обоих концах червя (помечены “присоединился”), до тех пор, как каждая линия прослеживает всю длину отдельного червя: Червь выравнивания скрипт индивидуально и последовательно выбирает каждую строку ИП, культур и выпрямляет его, так что каждая панель в окончательном монтаже будет представлять собой одну строку. В случае пересекающихся червей однако, хотя полная длина выпрямленных червей появляются для червя “пересекая1” и червя “intersecting2″ в монтаже (см. рисунок 5A-B), это явно заметно, что эти черви пересекают друг друга в оригинальном обзорном изображении. Таким образом, можно сделать вывод, что визуальная идентификация пересекающихся линий возможна из наложения изображения, найденного в подфолдере”данных” (рисунок 5A),а также из панелей отдельных червей в монтаже (рисунок 5B). Кроме того, любое перекрытие червей/линий может быть идентифицировано из таблицы контроля качества (КК), генерируемой для каждого обработанного изображения Червем-выравниванием, и сохранено в подфолдере данных. В этой таблице замыкаются три параметра для каждого из линейных ИИ, нарисованных на изображении (см. рисунок 5C):Из них длина указывает на длину линии рентабельности инвестиций, что является хорошим показателем размера червя; и номер Worm указывает порядок, в котором линии были нарисованы на обзоре изображения. Наконец, последний столбец указывает, существует ли перекрытие между червем/линией, о котором идет речь, и любым из других червей/линий, выбранных на изображении. В случае перекрытия число в этой колонке будет отличаться от числа, перечисленного в столбце worm. В сочетании с изображением наложения, таблица КК должна помочь исследователю принимать обоснованные решения о том, какие черви должны быть исключены из монтажа и/или количественной оценки. Выход Червь-выравнивание может быть использован для последующей количественной оценки интенсивности флуоресценции у одиноких червей. В FIJI, линия ROIs может быть использована для измерения интенсивности флуоресценции в исходных данных изображения, например, путем выполнения простого скрипта FIJI ‘ Worm-quant.ijm’, который также можно найти в репозитории Worm-aligny на Github. Кроме того, выход Worm-align может быть импортирован в программное обеспечение для анализа изображений третьих лиц. Мы демонстрируем это, импортируя выход Worm-align из двух наборов данных в Worm_CP, конвейер, который мы создали в CellProfiler. Worm_CP использует файлы в субфолдере ‘CellProfiler’ папки вывода Worm-align для тонкой настройки сегментации масок тех отдельных червей, выбранных во время выполнения макроса Worm-align. В частности, он использует маску линии (названный: Lines_), чтобы изолировать выбранных червей от популяции червей, замеченных в двоичной маске (названный: Mask_). Следует отметить, что линии, пересекающиеся на обзорномизображении (рисунок 5A),хотя и не являются проблемой для генерации монтажей, являются проблематичными для Worm_CP трубопровода. Почему это так, иллюстрируется на рисунке 5 D-E. Worm_CP использует маску линии(рисунок 5D), а не отдельные ROIs для оказания помощи в идентификации отдельных червей. Пересекающаяся линия, нарисованная второй во время выполнения Worm-align, накладывается на первую линию, и поэтому интенсивность вдоль этой линии будет иметь roi2, в том числе в бите, где линия 1 и 2 перекрывается. В результате CellProfiler будет сегментировать линию2 как один объект, но line1 как два объекта, которые разделены, где он пересекается с линией2. Это означает, что CellProfiler будет производить две (половина) маски червя для червя ‘intersecting1’ (Рисунок 5E). Самый простой способ исключить эти события из окончательного анализа (при необходимости) — определить количество червей пересекающихся червей из таблицы КК (субфолдер данных) и удалить измерения этих червей из выходных файлов CellProfiler. Пожалуйста, обратите внимание, что черви не обязательно будут выделены одинаковое число в FIJI и CellProfiler: Для идентификации номера червя FIJI в выходе CellProfiler посмотрите на значения Intensity_Max_Intensity в файле вывода ‘Lines.csv’. Любое Intensity_Max_Intensity значение, которое отображается в таблице “Lines.csv” более одного раза на изображение, является признаком окупаемости этой линии, что приводит к перелому маски червя. После того, как отдельные маски червя сегментированы, Worm_CP может измерить интенсивность флуоресценции в выбранных червей для всех записанных каналов. Все измерения взяты из исходных (сырых) данных изображения, хотя следует отметить, что CellProfiler автоматически перемасштабирововывал интенсивность пикселей по шкале 0-1. Это достигается путем деления значения интенсивности необработанных пикселей на максимально возможную интенсивность пикселей для изображения. В случае 8-битных изображений это значение составляет 255, а в случае 16-битных изображений это 65535. Поэтому значения интенсивности CellProfiler должны умножаться на максимально возможное значение интенсивности, чтобы восстановить значения, эквивалентные необработанным данным изображения. Выход Worm_CP состоит из двух файлов csv, ‘worms.csv’ и ‘Lines.csv’ которые сохраняются в выбранной папке вывода. При проверке этих файлов, ясно, что CellProfiler записывает большое количество параметров, связанных с интенсивностью флуоресценции. Из них Intensity_IntegratedIntensity соответствует общей флуоресценции на червя (т.е. сумме интенсивности флуоресценции во всех пикселях, которые истолковывают маску отдельного червя). Параметр Intensity_MeanIntensity средней интенсивности флуоресценции у отдельного червя (т.е. средней интенсивности флуоресценции на пиксель для всех пикселей, содержащихся в отдельном черве). В связи с случайным возникновением (малых) ошибок в сегментации червь маски рекомендуется, чтобы средние измерения интенсивности используются при сравнении флуоресценции измерений отдельных червей между двумя условиями. Если вы хотите вычесть фоновую флуоресценцию из количественных мер, используйте measurments, названные MeanIntensity_Threshold. Мы использовали трубопровод Worm_CP для количественной оценки интенсивности флуоресценции от фиксированных животных, которые были помечены флуоресцентным красителем, который включает в липидные капли (LDs) (Рисунок 6). Для проверки количественной оценки флуоресценции из трубопровода Worm-align/Worm_CP мы количественно околимленную интенсивность флуоресценции в том же наборе червей из набора данных BODIPY либо трубопроводом Worm-align/Worm_CP, либо ручной количественной оценкой в FIJI/ImageJ. Ручная количественная оценка была выполнена на FIJI/ImageJ путем обхода каждого червя, а также темной фоновой зоны на каждом изображении. Интенсивность флуоресценции была измерена в менеджере рентабельности инвестиций, и значение, измеренное для фона изображения, было вычтено из измерения флуоресценции червя каждого червя,как описано 17. Мы сравнили диких червей типа (WT) N2 с мутантами dbl-1(nk3), которые демонстрируют снижение содержания липидных капель18. Как и ожидалось, зеленая флуоресценция интенсивность значительно снижается между WT и dbl-1(nk3) червей с обоими методами(рисунок 6A,B). Примеры выровненных червей можно наблюдать на рисунке 6C,D. Содержание липидных капель снижается на 17% (p-value’lt;0.0001, неоплаченный т-тест) между WT и dbl-1(nk3) с помощью ручной количественной оценки, и на 14% (p-value-0.0051 неоплаченный т-тест) с помощью трубопровода Worm_CP. Снижение содержания липидных капель наблюдается здесь, в dbl-1(nk3) с обоими методами количественной оценки в соответствии слитературой 18. Это показывает, что количественная оценка приобретенных изображений флуоресценции с помощью Worm_CP CellProfiler сравнима с ручной количественной оценкой. Мы также использовали Worm_CP для количественной оценки реакции теплового удара в живых червей, выражаюющих GFP под контролем теплового удара неодобоваемого гена hsp-70 (C12C8.1)9. На рисунке 7 показаны репрезентативные изображения живых C. elegans, несущих теплоотзвукий hsp-70 (C12C8.1)p::Репортер GFP. При отсутствии теплового стресса черви не вызывают экспрессии GFP(рисунок 7A,B). Однако, когда черви подвергаются короткому тепловому удару в 30 мин при температуре 34 градусов по Цельсию, они вызывают выражение GFP(рисунок 7C,D). Уровни экспрессии GFP с тепловым шоком и без него количественно определены на рисунке 7E. В нынешнем виде Worm_CP является очень основным трубопроводом. Тем не менее, этот подход позволяет более точную сегментацию отдельных масок червя, что позволяет более точную количественную оценку интенсивности флуоресценции у тех червей, отобранных из изображения. По этой причине мы предпочитаем этот подход грубой количественной оценке в FIJI, используя только линейные маски. Кроме того, CellProfiler предлагает преимущество, что дополнительные модули анализа могут быть легко включены в конвейер. Например, для набора данных, который смотрит на содержание липидных капель, вставка дополнительных модулей в конвейер Worm_CP может исследовать липидные капли номера и интенсивность флуоресценции отдельных капель в этих червей, выбранных в обзоре изображений. Рисунок 1: Создание рот микропайп . Стеклянная капиллярная удлиняется в пламени горелки Bunsen(A), пока не обеспечивает тонкие удлиненные конечности (B). Расширенный стеклянный капилляр затем подключен к адаптер кусок рот микропипюты. (C)Схема микропайетта рта. Микропипет для рта был собран со стеклянным капилляром, подключенным к адаптеру. Силиконовая трубка диаметром 6 мм соединяет адаптер с фильтром шприца диаметром 0,2 мкм, используемым для обеспечения безопасности. Другой конец фильтра крепится к 3-мм силиконовой трубке, заканчиваемой наконечником фильтра 1mL. Экспериментатор может аспирировать через кончик фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Стремление жидкости, окружающей червя гранулы, используя рот микропипюты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Добавление крышки на червей, лежащих на агарозной площадке Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: Примеры выпрямления червя с помощью Червь-выравнивание на флуоресценции изображения, приобретенные у живых животных, несущих транскрипционного репортера жира-7p::GFP в кишечнике и красный маркер совместной инъекции в глотке (myo-2p::tdtomato). (A)Скриншот композитного изображения, приобретенного на флуоресцентном микроскопе живых червей в день 3 взрослой жизни. Изображение было открыто с помощью Worm_align и линии были нарисованы вдоль продольной оси червей с помощью Worm-выравнивания. (B)Скриншот того же изображения, что и в (A), с примерами прокомментировал хороший и плохой рисунок линий вдоль оси червей, используя Червь выравнивания. (C)Примеры линий, нарисованных поверх червей, которые могут подняться до неправильно выровненных червей. Червь выравнивания выход червей, выбранных в B. Изображения были приняты с 20x цель на перевернутый широкоугольный микроскоп (см. Таблицу материалов) с зеленой флуоресценции интенсивности No 1, воздействия 60 мс и красный флуоресценции интенсивности No 8, экспозиция 60 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Примеры выпрямления червя с помощью Червя-выравнивания на пересекающихся червей. (A) Скриншот композитного изображения, приобретенного на флуоресцентный микроскоп живых червей в день 3 взрослых животных проведения транскрипционного репортера жира-7p::GFP в кишечнике и красный маркер совместной инъекции в глотке (myo-2p::tdtomato). Пересекающиеся черви помечены как “пересекающиеся1” и “пересекающиеся2”, в то время как не пересекающиеся черви помечены как “хорошие3” и “хорошие4”. (B) Монтаж, созданный Червь-выравнивание представляющих выпрямленных червей, выбранныхв( A ). В монтаже заметно, что черви 1 и 2 пересекались на исходном изображении (черви помечены как “пересекаясь1” и “пересекаясь2”). (C)Скриншот таблицы КК от Worm-align, который позволяет обнаружить случаи, когда черви пересекаются. Длина: длина линии рентабельности инвестиций; номер червя: порядок, в котором были нарисованы линии; последний столбец указывает, существует ли перекрытие между червем/линией интереса и любым другим червем. В этом примере червь в первом сыром (червь номер1) перекрывается с червем номер 2, о чем свидетельствует число “2” в последней колонке. (D) Скриншот линий, нарисованных с Червь-выровнять на четырех червей, выбранных вA.( E ) Скриншот масок, порожденных Червь-выровнять на четырех червей, выбранных в, показывая, как маски для двух пересекающихся червей отображаются. В этом случае две маски вместо одной теперь соответствующи червю “intersecting1”. Изображения были сделаны с 20x цель на перевернутом широкоугольный микроскоп (см. Материалы таблице) с зеленой флуоресценции интенсивности 1, воздействия 60ms и красный флуоресценции интенсивности No 8, экспозиция 60 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Worm_CP измеряет флуоресценцию так же точно, как и ручная количественная оценка. Сравнение флуоресценции количественно молодых взрослых червей фиксированной и окрашенных для содержания липидных капель с зеленым флуоресцентным красителем BODIPY, используя либо Worm_CP трубопровода (A) или ручной количественной оценки (B). Содержание липидных капель WT и dbl-1 (nk3) отслеживалось путем фиксации и окрашивания животных БОДИПИ, которые перекалибровывания в жирные кислоты липидных капель (см. протокол А). Молодые взрослые животные были зафиксированы с 60% изопропанола и окрашенных с BODIPY для 1h. Тот же набор животных был количественно либо с помощью трубопровода Worm_CP (см. шаг 7) или ручной количественной оценки в соответствии со стандартнымипроцедурами 17. (A)Количественная оценка флуоресценции с использованием Worm_CP трубопровода. WT: n’22 животных, средняя флуоресценция 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3): n’25 животных, средняя флуоресценция 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. Неоплаченный t-test. b) Ручная количественная оценка флуоресценции. WT: n’22 животных, средняя флуоресценция 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n’25 животных, средняя флуоресценция 0,8632 ± 0,109 SD. Неоплаченный т-тест. (C, D) Пример представителя или выход Worm-Align для WT(C) и dbl-1(nk3) (D) животныхвыпрямленных с трубопроводом Worm-align. Изображения были сделаны с 20x целью на перевернутом микроскопе widefield (см. Таблицу материалов) с зеленой интенсивностью флуоресценции 2, exposure-60ms. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 7: Пример количественной оценки флуоресценции и выравнивания живых червей из изображений флуоресценции живых червей, несущих транскрипционные репортер hsp-70(C12C8.1)p::GFP после теплового удара. (A) После короткого теплового удара (30 мин при температуре 34 градусов по Цельсию), молодые взрослые черви были восстановлены при температуре их выращивания (25 градусов по Цельсию) и установлены затем изображены 3,5h после теплового удара. Около 30 червей были количественно после теплового удара с помощью червя выравнивания трубопровода. (A-B) Примеры выровненных червей, которые не подверглись тепловому удару. (C-D) Примеры тепловых червей, несущих hsp-70 (C12C8.1)p::GFP с помощью Worm-align. (E) показывает GFP Средняя интенсивность (параметр Worm_CP: MeanIntensity_Threshold) ВТ молодых взрослых червей, выращенных, без теплового удара или при воздействии теплового удара (34 кк в течение 30 мин). Изображения были сделаны с целью 20x на перевернутом микроскопе widefield (см. таблицу материалов) с зеленой интенсивностью флуоресценции 1, выдержкой 60ms; нет HS: n-12, HS: n-32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительная цифра 1: Расположение на FIJI, где после установки можно найти макрос Червя-выравнивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: Выбор папки, содержащей все изображения, сделанные с одинаковыми настройками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 3: Поколение 4 субфолдеров в папке вывода в FIJI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 4: Рисование линии по ширине червя и настройки канала для монтажа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная цифра 5: Предварительный просмотр изображения с примененными настройками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная цифра 6: Рисование линии вдоль продольной оси червей, представляющих интерес для включения в монтаж и/или количественную оценку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 7: Монтаж выбранных червей в папке вывода, под папкой “выровнены”. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 8: Очистка предыдущих изображений из предыдущего анализа в Cell Profiler. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная диаграмма 9: Импорт метаданных в CellProfiler из папки вывода Worm-align, выбрав подсвое .csv настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 10: Конвейер CellProfiler Worm_CP.cpproj использует изображения Lines_ для сингла выбранных червей (A) и производит одиночные маски червей, представляющих интерес (C). Трубопровод также измеряет фоновую интенсивность (B). Перспективы всех параметров, измеренных конвейером, Worm_CP.ccproj, которые экспортируются в файле csv (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительная цифра 11: Выбор выходных файлов в “ExportToSpreadsheet в Worm_CP.cpproj. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.