벌레 정렬 및 Worm_CP, Caenorhabditis elegans에서 얻은 형광 이미지 데이터의 스트레이트 및 정량화를 위한 두 개의 오픈 소스 파이프라인

이 프로토콜에 설명된 방법에 따라 C. elegans를 배양하고 이미징하면 웜 개체수의 큰 개요 이미지가 생성됩니다. 이러한 이미지에서 웜의 육안 검사 및 분류를 용이하게 하기 위해 웜 정렬을 개발했습니다. 웜 정렬은 간단하고 사용자 친화적인 FIJI 스크립트로 곧게 펴고 정렬된 웜의 몽타주를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 웜은 웜의 세로 축을 따라 선을 그려 개요 이미지에서 선택됩니다. 선택한 각 웜에는 숫자가 할당되고, 자르고 곧게 펴고, 몽타주에 추가됩니다. 몽타주 이미지 당 생성하거나 원래 입력 폴더의 모든 이미지를 결합할 수 있습니다. 예상대로 파이프라인의 출력은 주로 이미지 위에 그려진 선의 품질에 따라 달라집니다. 이 점을 설명하기 위해 그림 4에서는 여러 줄 예제와 웜 정렬의 출력이 표시됩니다. 머리에서 꼬리 끝까지 전체 선이 제대로 정렬된 웜(“양호”이라고 표시)을 생성합니다. 도 4는 웜 정렬을 실행하는 동안 부정확성을 추적하는 것이 정렬의 출력에 미치는 영향을 보여줍니다. 그림 4C에포함 된 점타 4C에 포함 된 점타에서, 그들은 웜의 적절한 정렬을 방해로, 다음과 같은 오류를 피하기 위해주의를 기울여야한다 : 머리에서 꼬리까지 벌레의 일관성없는 추적 (“꼬리에서 머리까지”라고 표시). 이렇게 하면 웜이 정렬에서 서로 다른 방향(즉, 꼬리대머리 대 머리-투-테일)으로 방향을 지정합니다. 불완전한 추적(“불완전”이라고 표시). 이것은 몽타주에 대해 잘라낸 것으로 추적된 웜의 일부만 발생합니다. 단일 추적에 여러 웜을 포함합니다(“두 개의 머리가 있는 웜”이라고 표시). 이로 인해 이웃이 몽타주 패널에 삽입됩니다. 이미지에 임의의 선을 추가합니다(“임의”라고 표시). 이것은 몽타주에 임의의 패널의 삽입귀착됩니다. 몽타주를 만들기 위해 두 개의 개별 선이 교차하거나(“교차”라고 표시됨) 또는 각 선이 개별 웜의 전체 길이를 추적하는 한 웜의 양쪽 끝에 결합되는 경우 문제가 되지 않습니다. 그러나 교차하는 웜의 경우, 전체 길이의 직선 웜이 몽타주에서 웜 “교차1″과 웜 “교차2″에 나타나지만(그림 5A-B참조), 이러한 웜이 원래 개요 이미지에서 서로 교차하는 것이 눈에 띈다. 따라서, 교차선의 시각적 식별은 몽타주(도5B)에서개별 웜의 패널뿐만 아니라 ‘데이터’ 서브폴더(도5A)에서발견되는 오버레이 이미지로부터 가능하다는 결론을 내릴 수 있다. 또한 웜/라인의 중복은 웜 정렬에 의해 처리된 각 이미지에 대해 생성된 품질 관리(QC) 테이블에서 식별하고 데이터 하위 폴더에 저장할 수 있습니다. 이 표는 이미지에 그려진 각 라인 ROI에 대해 세 가지 매개 변수를 기록합니다(그림 5C참조): 이 중 길이는 웜 크기의 좋은 지표인 라인 ROI의 길이를 나타냅니다. 웜 번호는 개요 이미지에 선이 그려진 순서를 나타냅니다. 마지막으로 마지막 열은 문제의 웜/선과 이미지에서 선택한 다른 웜/선 사이에 겹치는지 여부를 나타냅니다. 겹치는 경우 이 열의 숫자는 웜 번호 열에 나열된 번호열과 다릅니다. 오버레이 이미지와 함께, QC 테이블은 웜이 몽타주 및 / 또는 정량화에서 제외되어야하는 학습 된 결정을 내릴 연구원을 지원해야합니다. 웜 정렬의 출력은 단일 웜에서 형광 강도의 후속 정량화에 사용될 수 있다. FIJI에서 라인 ROI는 원래 이미지 데이터에서 형광 강도를 측정하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어 Github의 웜 정렬 리포지토리에서 찾을 수 있는 간단한 FIJI 스크립트 ‘웜-퀀트.ijm’을 실행하여 볼 수 있다. 또는 웜 정렬 출력을 타사 이미지 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다. 셀프로파일러에서 생성된 파이프라인인 두 데이터 집합의 웜 정렬 출력을 Worm_CP 가져옵니다. Worm_CP 웜 정렬 출력 폴더의 ‘CellProfiler’ 하위 폴더에 있는 파일을 사용하여 웜 정렬 매크로를 실행하는 동안 선택한 개별 웜의 세분화 마스크를 미세 조정합니다. 특히, 라인 마스크(이름: Lines_)를 사용하여 이진 마스크에서 볼 수 있는 웜 모집단으로부터 선택된 웜을 격리합니다(이름: Mask_). 몽타주 생성에 문제가 되지는 않지만 개요이미지(그림 5A)에교차하는 선은 Worm_CP 파이프라인에 문제가 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 경우, 도 5 D-E에설명되어 있습니다. Worm_CP 개별 웜의 식별을 돕기 위해 개별 ROI가 아닌 라인마스크(도 5D)를사용합니다. 웜 정렬을 실행하는 동안 두 번째로 그려진 교차선은 첫 번째 줄에 겹쳐지므로 이 선을 따라 강도는 1호선과 2선이 겹치는 비트를 포함하여 ROI2의 강도입니다. 따라서 CellProfiler는 line2를 하나의 개체로 분할하지만 line1은 line2와 교차하는 두 개체로 구분됩니다. 이는 CellProfiler가 웜 ‘교차1′(그림 5E)에 대해 두 개의 웜 마스크를 생성한다는 것을의미합니다. 최종 분석에서 이러한 이벤트를 제외하는 가장 쉬운 방법은 QC 테이블(데이터 하위 폴더)에서 교차하는 웜 수를 식별하고 CellProfiler 출력 파일에서 이러한 웜에 대한 측정값을 제거하는 것입니다. 웜은 반드시 피지와 CellProfiler에서 동일한 번호를 할당되지 않습니다 : CellProfiler 출력에서 피지 웜 번호를 식별하려면 ‘라인.csv 출력 파일의 Intensity_Max_Intensity 값을 볼 수 있습니다. 이미지당 ‘선.csv 테이블에 나타나는 Intensity_Max_Intensity 값은 해당 라인 ROI의 표시로 인해 웜 마스크가 골절됩니다. 개별 웜 마스크가 분할되면 Worm_CP 기록된 모든 채널에 대해 선택한 웜의 형광 강도를 측정할 수 있습니다. 모든 측정은 원래(원시) 이미지 데이터에서 가져온 것이지만 CellProfiler는 자동으로 0-1의 배율로 픽셀 강도를 재조정한다는 점에 유의해야 합니다. 이는 원시 픽셀 강도 값을 이미지에 대해 가능한 최대 픽셀 강도로 나누어 얻을 수 있습니다. 8비트 이미지의 경우 이 값은 255이며 16비트 이미지의 경우 65535입니다. 따라서 CellProfiler 강도 값은 원시 이미지 데이터와 동일한 값을 회복하기 위해 가능한 최대 강도 값을 곱해야 합니다. Worm_CP 출력은 선택한 출력 폴더에 저장된 두 개의 csv 파일인 ‘웜.csv’과 ‘라인.csv(lines.csv)으로 구성됩니다. 이러한 파일을 검사하는 동안 CellProfiler는 형광 강도와 관련된 많은 수의 매개 변수를 기록합니다. 이들 중, Intensity_IntegratedIntensity 웜당 총 형광(즉, 개별 웜의 마스크를 해석하는 모든 픽셀 내의 형광 강도의 합)에 해당한다. 매개 변수 Intensity_MeanIntensity 개별 웜 내의 평균 형광 강도를 지칭한다(즉, 개별 웜 내에 포함된 모든 픽셀에 대한 픽셀당 평균 형광 강도). 웜 마스크를 분할하는 동안 (작은) 오류가 발생하기 때문에 두 조건 사이의 개별 웜의 형광 측정을 비교할 때 MeanIntensity 측정을 사용하는 것이 좋습니다. 정량화된 측정에서 배경 형광을 빼고 싶다면 MeanIntensity_Threshold 명명 된 측정을 사용합니다. 우리는 지질 물방울 (LDs)에 통합형염료로 표시 된 고정 동물에서 형광 강도를 정량화하기 위해 Worm_CP 파이프 라인을 사용했다(도 6). 웜 정렬/Worm_CP 파이프라인으로부터 형광 정량화를 검증하기 위해, 우리는 WORM-align/Worm_CP 파이프라인 또는 FIJI/ImageJ의 수동 정량화에 의해 BODIPY 데이터 집합에서 동일한 웜 세트에서 형광 강도를 정량화했습니다. 수동 정량화는 모든 이미지의 어두운 배경 영역뿐만 아니라 각 웜을 순환하여 FIJI / ImageJ에서 수행되었다. 형광 강도는 ROI 관리자에서 측정되었고 이미지 배경에 대해 측정된 값은 설명된17과같이 각 웜의 웜 형광 측정에서 빼되었다. 우리는 야생 유형 (WT) N2 웜을 dbl-1 (nk3) 돌연변이체에 비교하여 지질 방울함량이 감소했습니다(18). 예상대로, 녹색 형광 강도는 두 가지방법(그림 6A, B)을가진 WT와 dbl-1(nk3) 웜 사이에 현저히 감소된다. 정렬된 웜의 예는 도 6C,D에서관찰될 수 있다. 지질 방울 함량은 수동 정량화를 사용하여 WT와 dbl-1(nk3) 사이에 17%(p-value&0.0001, 페어링되지 않은 t-test)를, 그리고 Worm_CP 파이프라인을 사용하여 14%(p-값=0.0051 미페어링 t-test)로 감소합니다. 두 정량화 방법을 모두 가진 dbl-1(nk3)에서 여기에서 관찰되는 지질 액적 함량의 감소는문헌(18)에따른다. 이는 Worm_CP CellProfiler 파이프라인을 사용하여 획득한 형광 이미지의 정량화가 수동 정량화와 유사하다는 것을 보여줍니다. 우리는 또한 열 충격 유도 유전자 hsp-70 (C12C8.1)9의통제하에 GFP를 표현하는 살아있는 벌레에서 열 충격 반응을 정량화하기 위하여 Worm_CP 이용했습니다. 그림 7은 열 반응형 hsp-70(C12C8.1)p::GFP 리포터를 운반하는 라이브 C. 엘레건의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 열 응력의 부재시, 벌레는 GFP 발현(도7A,B)을유도하지 않는다. 그러나, 벌레가 34°C에서 30분의 짧은 열 충격에 노출되면 GFP 발현(도7C,D)을유도한다. 열충격의 유무에 관계없이 GFP 발현 수준은 도 7E에서정량화된다. 그것은 스탠드로, Worm_CP 매우 기본적인 파이프 라인입니다. 그러나, 이 접근은 개별 웜 마스크의 보다 정확한 세분화를 가능하게 합니다, 이는 이미지에서 선택된 그 벌레에 있는 형광 강도의 보다 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 이러한 이유로, 우리는 단지 라인 마스크를 사용하여, 피지에서 거친 정량화보다이 방법을 선호합니다. 또한 CellProfiler는 추가 분석 모듈을 파이프라인에 쉽게 포함할 수 있다는 이점을 제공합니다. 예를 들어 지질 방울 함량을 보는 데이터 집합의 경우 Worm_CP 파이프라인에 추가 모듈을 삽입하면 개요 이미지에서 선택한 웜에서 개별 물방울의 지질 방울 수와 형광 강도를 조사할 수 있습니다. 그림 1: 입 마이크로파이프 생성. 유리 모세관은 번젠버너(A)의불꽃에서 연장되어 얇은 길쭉한 사지(B)를 제공합니다. 확장 된 유리 모세관은 입 마이크로 피펫의 어댑터 조각에 연결됩니다. (C)입 마이크로파이프의 회로도. 입 마이크로피펫은 어댑터에 연결된 유리 모세관으로 조립되었습니다. 6mm 실리콘 튜브는 어댑터를 안전에 사용되는 0.2 μm 주사기 필터에 연결합니다. 필터의 다른 쪽 끝은 1mL 필터 팁으로 끝나는 3mm 실리콘 튜브에 부착됩니다. 실험자는 필터 팁을 통해 흡인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 입 마이크로피펫을 사용하여 벌레 펠릿을 둘러싼 액체의 포부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 아가로즈 패드에 누워 있는 벌레에 커버슬립을 추가하려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오. 도 4: 전사 기자 지방-7p를운반하는 살아있는 동물로부터 획득한 형광 이미지에 웜-정렬을 이용한 웜 스트레이트의 예: :장내 GFP 및 인두(myo-2p:tdtomato)의 적합한 공동 주입 마커.. (A)성인 3일째에 살아있는 벌레의 형광 현미경에 획득한 합성 영상의 스크린샷. 이미지는 Worm_align 열었으며 웜 정렬을 사용하여 웜의 세로 축을 따라 선이 그려졌습니다. (B)웜 정렬을 사용하여 웜의 축을 따라 선의 좋은 및 나쁜 드로잉을 주석으로 한 예와 함께(A)와같은 이미지의 스크린 샷. (C)잘못 정렬된 웜으로 상승할 수 있는 웜 위에 그려진 선의 예입니다. B. 이미지에서 선택된 웜의 웜 정렬 출력은 녹색 형광 강도=1, 노출=60 ms 및 적색 형광 강도 = 8, 노출=60 ms. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 반전된 광야 현미경(재료 표 참조)에 대한 20배 의 목표로 촬영하였다. 그림 5: 교차하는 웜에 웜 정렬을 사용하여 곧게 펴는 웜의 예입니다. (A)전사 기자 지방-7p를들고 있는 성인이 된 동물의 3일째에 살아있는 벌레의 형광 현미경으로 획득한 합성 영상의 스크린샷: :GFP 내장및 인두에 적색 공동 주입마커(myo-2p:tdtomato). 교차하는 웜은 “교차1” 및 “교차”라고 표시되며 겹치지 않는 웜은 “good3” 및 “good4″로 표시됩니다. (B)선택된 바로간 웜을 나타내는 웜 정렬에 의해 생성된 몽타주(A). 몽타주에서 는 벌레 1과 2가 원본 이미지에 교차하고 있었다는 것이 눈에 띈다(웜은 “교차1″과 “교차2″로 표시). (C)웜 정렬에서 QC 테이블의 스크린샷이 웜이 교차하는 경우를 발견할 수 있습니다. 길이: ROI 라인의 길이; 웜 번호: 선이 그려진 순서; 마지막 열은 관심 있는 웜/줄과 다른 웜 사이에 겹치는지 여부를 나타냅니다. 이 예에서 첫 번째 원시(웜 넘버1)의 웜은 마지막 열의 숫자 “2”로 표시된 웜 번호 2와 겹칩니다. (D)A.(E) A에서 선택된 4개의 웜에웜-정렬으로 그려진 선의 스크린샷은 A에서 선택된 4개의 웜에 웜 정렬에 의해 생성된 마스크의 스크린샷으로, 교차하는 두 웜에 대한 마스크가 어떻게 렌더링되는지를 보여준다. 이 경우, 하나 대신 두 개의 마스크는 이제 웜 “교차1″에 대응한다. 이미지는 녹색 형광 강도 =1, 노출 = 60ms 및 적색 형광 강도 = 8, 노출 = 60 ms. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하여 반전 된 광장 현미경 (재료 표 참조)에 20 배 의 목표로 촬영했습니다. 그림 6: Worm_CP 파이프라인은 수동 정량화와 마찬가지로 형광을 정확하게 정량화합니다. 녹색 형광염료 BODIPY와 지질 방울 함량을 고정 하고 염색한 젊은 성인 웜의 형광 정량화의 비교는 Worm_CP파이프라인(A)또는 수동 정량화(B)를 사용합니다. WT 및 dbl-1(nk3)의 지질 방울 함량은 지질 방울의 지방산으로 인터카로 삽입되는 BODIPY로 동물을 고정하고 염색하여 모니터링되었습니다(프로토콜 A 참조). 젊은 성인 동물은 60 %의 이소 프로파놀로 고정되었고 1 시간 동안 BODIPY로 얼룩졌습니다. 동일한 동물 세트는 Worm_CP 파이프라인(7단계 참조)을 사용하거나 표준절차(17)에따라 수동 정량화하여 정량화하였다. (a)Worm_CP 파이프라인을 이용한 형광의 정량화. WT: n=22 동물, 평균 형광 = 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1 (nk3):n=25 동물, 평균 형광 = 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. 미페어링 T-테스트. (B) 형광의 수동 정량화. WT: n=22 동물, 평균 형광 = 1.048 ± 0.153 SD; dbl-1 (nk3): n =25 동물, 평균 형광 = 0.8632 ± 0.109 SD. 미페어링 t-테스트. (C, D) WT(C)및 dbl-1(nk3) (D)동물에 대한 대표적인 예 또는 웜-정렬 출력이 웜 정렬 파이프라인으로 곧게 된다. 이미지는 녹색 형광 강도 =2, 노출 = 60ms와 반전 된 와이드 필드 현미경 (재료 테이블 참조)에 20 배 목표로 촬영했다. 도 7: 전사 기자 hsp-70(C12C8.1)p::GFP 다음 열 충격을 운반하는 살아있는 벌레의 형광 이미지로부터 의 형광 정량화 및 실시간 웜정렬의 예. (A)짧은 열 충격(34°C에서 30분) 경상수지에서 젊은 성인 벌레를 재배 온도(25°C)에서 회수한 다음 3.5시간 후 열 충격을 이미지화하였다. 웜 정렬 파이프라인을 사용하여 열 쇼크 후 약 30개의 웜이 정량화되었습니다. (A-B) 열 충격에 노출되지 않은 정렬 된 웜의 예입니다. (C-D) hsp-70(C12C8.1)p::GFP를 사용하여 웜 정렬을 운반하는 열 충격 웜의 예. (E)열 충격없이 또는 열 충격 (30 분 동안 34 °C)에 노출시 성장 한 WT 젊은 성인 웜의 GFP 평균 강도 (Worm_CP 매개 변수 : MeanIntensity_Threshold)를 나타낸다. 이미지는 녹색 형광 강도 =1, 노출 = 60ms와 반전 된 광야 현미경 (재료 테이블 참조)에 20 배 의 목표로 촬영했다; HS 없음: n=12, HS: n=32. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 1: 웜 정렬 매크로를 찾을 수 있는 피지의 위치, 일단 설치. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 추가 그림 2: 동일한 설정으로 촬영한 모든 이미지가 포함된 폴더 선택입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 3: 피지의 출력 폴더에 4 개의 하위 폴더의 생성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 4: 몽타주에 대한 웜 및 채널 설정의 폭을 가로 질러 선의 그리기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 추가 그림 5: 적용된 설정으로 이미지 미리 보기입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 6: 몽타주 및/또는 정량화에 포함하기 위한 관심 있는 벌레의 세로축을 따라 선을 그립니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 7: “정렬된” 폴더 아래 출력 폴더에 선택한 웜의 몽타주. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 도 8: 셀 프로파일러의 이전 분석에서 이전 이미지를 지우기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 추가 그림 9: 설정.csv 하위 폴더를 선택하여 웜 정렬 출력 폴더에서 셀 프로파일러로 메타데이터를 가져옵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 추가 도 10: CellProfiler 파이프라인 Worm_CP.cpproj는 Lines_ 이미지를 사용하여 선택한 웜(A)을 단일화하고 관심 있는 웜(C)의 단일 웜 마스크를 생성합니다. 파이프라인은 배경 강도(B)를 측정합니다. csv 파일(D)으로 내보내는 파이프라인 Worm_CP.ccproj에서 측정한 모든 매개 변수의 전망입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 추가 그림 11: Worm_CP.cpproj 파이프라인의 “ExportToSpreadsheet”에서 출력 파일 선택. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.