Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie
Summary
Eine Methode zur Abgabe neuronaler Stammzellen, anpassungsfähig für Injektionslösungen oder Suspensionen, durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) nach ischämischem Schlaganfall wird berichtet. Injizierte Zellen sind breit über das Gehirn Parenchym verteilt und kann bis zu 30 d nach der Geburt nachgewiesen werden.
Abstract
Die Therapie mit neuronalen Stammzellen (NSC) ist eine neue innovative Behandlung bei Schlaganfall, traumatischen Hirnverletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen. Im Vergleich zur intrakraniellen Verabreichung ist die intraarterielle Verabreichung von NSCs weniger invasiv und erzeugt eine diffusere Verteilung von NSCs innerhalb des Gehirnparenchyms. Darüber hinaus ermöglicht die intraarterielle Abgabe den Erstpasseffekt in der Hirnzirkulation, wodurch das Potenzial für das Einfangen von Zellen in peripheren Organen, wie Leber und Milz, verringert wird, eine Komplikation, die mit peripheren Injektionen verbunden ist. Hier beschreiben wir die Methodik, sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten, für die Lieferung von NSCs durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) an die ipsilaterale Hemisphäre nach einem ischämischen Schlaganfall. Anhand von GFP-markierten NSCs veranschaulichen wir die weitverbreitete Verteilung, die in der ipsilateralen Hemisphäre des Nagetiers bei 1 d, 1 Woche und 4 Wochen nach der postischen Verabreichung erreicht wird, mit einer höheren Dichte an oder in der Nähe der ischämischen Verletzungsstelle. Neben dem Langzeitüberleben zeigen wir Nachweise für eine Differenzierung von GFP-markierten Zellen nach 4 Wochen. Der hier für NSCs beschriebene intraarterielle Verabreichungsansatz kann auch für die Verabreichung therapeutischer Verbindungen verwendet werden und hat somit eine breite Anwendbarkeit auf verschiedene ZNS-Verletzungs- und Krankheitsmodelle über mehrere Arten hinweg.
Introduction
Die Stammzelltherapie (SC) birgt ein enormes Potenzial zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Schlaganfall, Kopftrauma und Demenz1,2,3,4,5,6., Eine effiziente Methode zur Lieferung exogener SCs an das erkrankte Gehirn bleibt jedoch problematisch2,6,7,8,9,10,11,12,13. SCs, die über periphere Verabreichungswege, einschließlich intravenöser (IV) oder intraperitonealer (IP) Injektionen, geliefert werden, unterliegen einer Erstpassfilterung in der Mikrozirkulation, insbesondere in der Lunge, Leber, Milz und Muskel8,9,13,14, erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Ansammlung von Zellen in Nicht-Ziel-Bereichen. Die invasive intracerebrale Injektionsmethode führt zu lokalisierten Hirngewebeschäden und einer sehr eingeschränkten Verteilung von SCs in der Nähe der Injektionsstelle2,6,8,14,15,16. Wir haben vor kurzem eine katheterbasierte intraarterielle Injektionsmethode eingeführt, um exogene neuronale SCs (NSCs) zu liefern, die hier in einem Nagetiermodell des fokalen ischämischen Schlaganfalls beschrieben wird. Wir induzieren vorübergehende (1 h) Ischämie-Reperfusionsverletzung in einer Hemisphäre mit einem Silikongummi beschichteten Filament, um die linke mittlere Hirnarterie (MCA) in der Maus oder Ratte17,18,19zu verschließen. In diesem Modell haben wir reproduzierbar etwa 75-85% Depression des zerebralen Blutflusses (CBF) in der ipsilateralen Hemisphäre mit Laser Doppler oder Laser speckle Imaging17,19beobachtet, was konsistente neurologische Defizite17,18,19ergibt.
Aus zeitsparenden Gründen wird das Video mit doppelter Normalgeschwindigkeit abgespielt und routinemäßige chirurgische Eingriffe wie Hautvorbereitung und Wundverschluss mit Naht und die Verwendung und Einrichtung der motorisierten Spritzenpumpe werden nicht dargestellt. Die Methode der intraarteriellen Abgabe von NSCs wird im Kontext des mittleren zerebralen Arterienverschlussmodells (MCAO) des experimentellen Schlaganfalls bei Nagetieren demonstriert. Daher schließen wir das transiente ischämische Schlaganfallverfahren ein, um später zu zeigen, wie die zweite Operation, die intraarterielle Injektion, mit der vorherigen chirurgischen Stelle am selben Tier durchgeführt wird. Die Durchführbarkeit der intraarteriellen NSC-Verabreichung in Nagetierschlagmodellen wird durch die Bewertung der Verteilung und des Überlebens exogener NSCs demonstriert. Die Wirksamkeit der NSC-Therapie zur Dämpfung der Hirnpathologie und neurologischen Dysfunktion wird separat berichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Stammzelltherapie bei neurologischen Erkrankungen befindet sich noch in einem frühen explorativen Stadium. Ein großes Problem ist, dass es keine etablierte Methode für eine ausreichende Bereitstellung von SCs oder NSCs in das Gehirn gibt.
Obwohl exogene SCs/NSCs im Gehirn nach intravenöser (IV), intraperitonealer (IP) oder intraparenchymaler/intracerebraler Injektion nachgewiesen werden können, hat jeder Verabreichungsansatz Nachteile. Die nachweisbare Population im Gehirn wird mit ei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt von den folgenden: AHA Award 14SDG20480186 für LC, Subject Innovation Team der Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 für BZ, und Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust Grant 14-12A für KES und LC.
Materials
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
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