Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

La competenza vettoriale è definita come la capacità a livello di specie, popolazione e persino individuo, di un dato artropode come una zanzara, una zecca o una mosca di sabbia flebotomina, di acquisire e trasmettere un agente biologicamente con replicazione o sviluppo nell’artropode^1,2. Per quanto riguarda le zanzare e i virus trasmessi dagli artropodi (cioè gli arbovirus), l’agente viene assorbito da un ospite viremico da una zanzara femmina. Dopo l’ingestione, il virus deve infettare in modo produttivo una di una piccola popolazione di cellule epiteliali dell’intestino medio³, superando vari ostacoli fisiologici come la degradazione proteolitica da parte degli enzimi digestivi, la presenza del microbiota (barriera di infezione dell’intestino medio, o MIB) e la matrice peritrofica secreta. L’infezione dell’epitelio midgut deve essere seguita dalla replicazione del virus e dall’eventuale fuga dal midgut nel sistema circolatorio aperto della zanzara, o emolinfa, che rappresenta l’insorgenza di un’infezione disseminata che supera la barriera di fuga del midgut (MEB). A questo punto il virus può stabilire infezioni dei tessuti secondari (ad esempio, nervi, muscoli e corpi adiposi) e continuare a replicarsi, sebbene tale replicazione secondaria possa non essere strettamente necessaria affinché il virus infetti le cellule acinari delle ghiandole salivari (superando la barriera di infezione della ghiandola salivare). L’uscita dalle cellule acinari della ghiandola salivare nelle loro cavità apicali e quindi il movimento nel dotto salivare consente l’inoculazione del virus in ospiti successivi al morso e completa il ciclo di trasmissione^1,2,4,5,6,7.

Dato questo meccanismo di diffusione ben caratterizzato e generalmente conservato all’interno di un vettore di zanzara, le valutazioni delle competenze vettoriali di laboratorio sono spesso metodologicamente simili, sebbene esistano differenze nei protocolli^1,2. Generalmente, dopo l’esposizione orale al virus, le zanzare vengono sezionate in modo che i singoli tessuti come l’intestino medio, le gambe, le ovaie o le ghiandole salivari possano essere analizzati per l’infezione virale, l’infezione disseminata, l’infezione disseminata / potenziale trasmissione transovarica e l’infezione disseminata / potenziale competenza di trasmissione, rispettivamente⁸. La semplice presenza di un virus nelle ghiandole salivari, tuttavia, non è una prova definitiva della capacità di trasmissione, data l’evidenza di una barriera di fuga/uscita della ghiandola salivare (SGEB) in alcune combinazioni vettore/virus^1,2,4,5,7,9. Il metodo standard per dimostrare la competenza di trasmissione rimane la trasmissione delle zanzare a un animale^{suscettibile10,11,12.} Tuttavia, dato che per molti arbovirus ciò richiede l’uso di modelli murini immunocompromessi^13,14,15,16,questo metodo è spesso proibitivo in termini di costi. Un’alternativa comunemente usata è la raccolta della saliva della zanzara, che può essere analizzata mediante reazione a catena trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) o un test infettivo per dimostrare la presenza del genoma virale o di particelle infettive, rispettivamente. Vale la pena notare che tali metodi di raccolta della saliva in vitro possono sovrastimare¹² o sottostimare¹⁷ la quantità di virus depositata durante l’alimentazione in vivo, indicando che tali dati devono essere interpretati con cautela. Tuttavia, il metodo in vitro è molto prezioso se analizzato dal punto di vista della semplice presenza di virus nella saliva, indicando il potenziale di trasmissione.

Esistono due approcci principali per determinare il ruolo dei vettori di zanzare nelle epidemie di malattie arbovirali. Il primo metodo prevede la sorveglianza sul campo, in cui le zanzare vengono raccolte nel contesto della trasmissione attiva^{18,19,20,21,22,23,24.} Tuttavia, dato che i tassi di infezione sono in genere piuttosto bassi (ad esempio, il tasso di infezione stimato dello 0,061% delle zanzare nelle aree di circolazione attiva del virus Zika (ZIKV) negli Stati Uniti²¹), l’incriminazione di potenziali specie di vettori può essere fortemente distorta dalla metodologia di cattura^25,26 e dalla casualità (ad esempio, campionando un individuo infetto su 1.600 non infetti)²¹ . Tenendo conto di ciò, un determinato studio potrebbe non acquisire zanzare sufficienti sia in numero grezzo che in diversità di specie per campionare accuratamente le zanzare coinvolte nella trasmissione. Al contrario, le analisi della competenza vettoriale vengono eseguite in un ambiente di laboratorio, consentendo un controllo rigoroso di parametri come la dose orale. Sebbene non pienamente in grado di rappresentare la vera complessità dell’infezione da zanzara e la capacità di trasmissione in un ambiente di campo, queste valutazioni di laboratorio rimangono potenti strumenti nel campo dell’arbovirologia.

Sulla base di varie analisi di competenza vettoriale con ZIKV in diverse specie di zanzare, popolazioni e metodi^{27,28,29,30,31,32,}nonché di una recente revisione delle valutazioni della competenza vettoriale^1,descriviamo qui molti dei protocolli associati a un tipico flusso di lavoro di competenza vettoriale. In questi esperimenti, tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (la città di Salvador, Brasile; repubblica Dominicana; e la bassa valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un singolo ceppo di ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 o 6 log₁₀ unità di focalizzazione (FFU) / mL dosi sotto forma di farine di sangue artificiali. Successivamente, sono stati analizzati per prove di infezione, infezione disseminata e competenza di trasmissione dopo vari periodi di incubazione estrinseca (2, 4, 7, 10 e 14 giorni) mediante dissezione e un test infettivo basato su colture cellulari. Sebbene l’attuale flusso di lavoro / protocolli sia ottimizzato per ZIKV, molti elementi sono direttamente traducibili in altri arbovirus trasmessi dalle zanzare nel contenimento degli artropodi e nei livelli di biosicurezza 2 e 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).