ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

אסטרוציטים לשחק פונקציות חיוניות רבות בהתפתחות המוח ופיזיולוגיה¹. לצד תפקידם במחסום הדם – מוח שבו הם מווסתים את ספיגת החומרים המזינים ואת זרימת הדם, הם תורמים באופן פעיל להיווצרות ותפקוד הסינפסה תוך הפקת נוירומודולטורים שיכולים לשנות פעילות עצבית והתנהגות². יתר על כן, תפקוד לקוי של אסטרוציטים תורם למגוון הפרעות נוירולוגיות³. אסטרוציטים הממוקמים בקליפת המוח מציגים מורפולוגיה משוכללת המאפשרת מגע נרחב עם תהליכים עצביים. מגעים אלה, חיוני לתפקוד מעגלי, שולטים גם במורפוגנזה אסטרוציטים ובסינפטוגנזה באמצעות חלבוני הידבקות בתאים⁴. מדעני מוח זקוקים לכלים נוחים וחזקים כדי לחקור התפתחות אסטרוציטים ומורפוגנזה במודלים הנוירולוגיים שלהם של עניין. עם זאת, בשל ההחמרה הקרובה של אסטרוציטים לשכניהם וריצוף תלת מימדי אחיד שלהם, זה מאתגר לבודד אסטרוציטים קליפת המוח ולהעריך באופן מקיף את המורפולוגיה שלהם באמצעות immunomarkers.

נכון לעכשיו, שתי אסטרטגיות הנדסה גנטית עיקריות מאפשרות תיוג ואינדיבידואליזציה של אסטרוציטים קליפת המוח במקום: הפעלת כתב דליל בקווי עכבר מהונדסים או טרנסגנזה סומטית באמצעות אלקטרופורציה של פלסמידים כתב. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הרבייה של קו עכבר כתב floxed עם עכברים המבטאים צורה בלתי ניתנת להסבר של Recombinase Cre המופעל במיוחד אסטרוציטים על משלוח טמוקסיפן (למשל, Aldh1l1-CreERT2⁵). מספר חסרונות קשורים לאסטרטגיה זו. ראשית, הרבייה של עכברים מהונדסים דורשת מספר רב של בעלי חיים ובדרך כלל יש צורך במבחנים מרובים כדי לקבוע את המינון הנכון של טמוקסיפן כדי לספק תיוג דליל כראוי של אסטרוציטים קליפת המוח. ניתוח פנוטיפים אסטרוציטים קליפת המוח במודל עכבר גנטי של עניין ידרוש אפילו יותר רבייה וצריכת עכבר. יתר על כן, בהזרקת טמוקסיפן הרחם ידוע להפריע parturition, מה שהופך אסטרטגיה זו קשה ליישם את המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות אסטרוציטים. In vivo DNA electroporation היא אסטרטגיה חלופית ללא טמוקסיפן המסתמכת על מספר מינימלי של בעלי^{חיים 6}. גישה זו, המבוצעת בשלבים עובריים או לאחר לידה, מורכבת מהזרקת פלסמידים עיתונאיים בחדרים הצדדיים של מכרסמים ואחריו פולסים חשמליים היוצרים נקבוביות בקרום התא, ומכאן מאפשרים לדנ”א להיכנס לתאי אב המצפים את החדר. לאחר מכן, transgenes הכתב נישא על ידי פלסמידים electroporated מעובדים על ידי מכונות התא ממוקד והביע⁷. שתי שיטות electroporation תוארו בעבר לתייג אסטרוציטים קליפת המוח של העכבר: 1) תיוג אסטרוציטים לאחר הלידה על ידי Electroporation (PALE), המסתמך על electroporation של 1-2 פלסמידים כתב אפיזומלי צבע יחיד בשלבים מוקדמים לאחר הלידה⁴; 2) האסטרטגיה StarTrack מבוסס על electroporation הרחם (IUE) של פלסמידים כתב אינטגרטיבי צבע יחיד מרובים^8,9,10. למרות שתי טכניקות אלה ביעילות תווית PrA בקליפת המוח, הם גם מציגים כמה מגבלות. בגרסה הראשונית שלהם, שתי השיטות מסתמכות על חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP) מקדם לנהוג ביטוי אסטרוציטים, אשר עשוי להטות את התיוג לכיוון גליה רדיאלי, כמו גם אסטרוציטים פייאל תגובתי המבטאים GFAP חזק יותר מאשר מנוחה רגילה PrA^11,12. לגבי PALE, חסרונות אחרים הם השלב המאוחר של electroporation, אשר מונע תיוג של פרה בגיל הרך (או אלה שמקורם אבות delaminating מוקדם) וניתוח של שלבים מוקדמים של התפתחות אסטרוליה, ושימוש וקטורים אפיזומליים שהופכים מדוללים באמצעות חטיבות רצופות במהלך התפשטות מסיבית כי פרה לעבור במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה^13,14. בניגוד ל- PALE, StarTrack מבוסס על אלקטרופוציה עוברית של פלסמידים עיתונאיים אינטגרטיביים המאפשרים מעקב אחר תרומתם של אבות עוברים ואחרי לידה ל- PrA. תוכנית StarTrack מעודכנת המסתמכת על מקדם Ubiquitin C (UbC-StarTrack) משיגה ביטוי רחב יותר של כתבים פלואורסצנטיים הן בירידה העצבית והן בירידה הגלית (כולל אסטרוציטים) של אבות עצביים^15,16,17. עם זאת, בגרסתה הנוכחית, יישום גישה זו הוא מורכב, שכן הוא מסתמך על תערובת שווה של 12 פלסמידים נפרדים המבטאים שישה חלבונים פלואורסצנטיים (FP) עם עירור חלקי וחפיפת ספקטרום פליטה.

מוצג כאן הוא פשוט בשיטת תיוג multicolor מבוססי אלקטרופורציה הרחם באמצעות מבני כתב אינטגרטיבי מונע על ידי מקדם חזק ופעיל באופן נרחב כדי לבודד אסטרוציטים קליפת המוח¹⁴. בנוסף, צינור ניתוח תמונה קל באמצעות מורשה (למשל, Imaris) וגישה פתוחה (Vaa3D^18,19,20) תוכנת ניתוח תמונה מסופקת לפלח נפח טריטוריאלי אסטרוציטים ו arborization, בהתאמה. בהשוואה לשיטות שתוארו לעיל, אסטרטגיה זו מסתמכת אך ורק על 1-2 טרנסגנים אינטגרטיביים צבעוניים מרובי סמני צבע משולבי גנום (סמני MAGIC או MM²¹) המופנים לתא התא הגרעיני הציטופלסמי (אופציונלי) שביטויו מונע על ידי מקדם CAG סינתטי המורכב משפר ציטומגלווירוס, מקדם העוף β-actin, ואתר מקבל β-גלובין^{splice 22}. זה מאפשר תיוג ומעקב של אסטרוציטים קליפת המוח, מעובר לשלבים מאוחרים לאחר הלידה, ללא תלות ביטוי GFAP^14,23. כל אחד מהטרנג’ינים האלה נושא את ארבעת ה-FP השונים הבאים: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP ו- tdTomato/mCherry, המציגים חפיפה ספקטרלית מינימלית שניתן לעקוף בקלות עם 1) רכישת ערוצים רציפים; 2) כוח עירור ממוטב ורווח איסוף; ו-3) מסננים דיכריים ספציפיים לאיסוף חלונות פליטת FP צרים. אסטרטגיית MM משתמשת רקומבינציה Cre /lox עם recombinase Cre עצמית excisable (seCre) כדי להניע ביטוי סטוכסטי של FP באוכלוסייה הסלולר. עותק יחיד של MM transgene מבטא את ה-FP באופן בלעדי הדדית, בעוד שטרנסג’ינים מרובים יוצרים שילובי FP ויוצרים עשרות גוונים שונים. אינטגרציה גנומית של הטרנסגנס מונעת על ידי מערכת טרנספוזיציה PB (PB) או Tol2^24,25,26. לכן, באמצעות electroporation הרחם, ערכת הכלים MM ואת “פסיפס” צבעוני שהיא מייצרת לאפשר סימון בו זמנית של אבות קליפת המוח הסמוכים מרובים ואת המעקב אחר הירידה הגלית שלהם, כולל אסטרוציטים קליפת המוח, על פני תקופות ארוכות. ניגודי צבעים הנובעים מהביטוי של חלוקה ברורה של FP היתר מתאר של קווי המתאר של PrA ולאחר מכן לחלץ מידע מפתח על נפח טריטוריאלי שלהם (באמצעות IMARIS) ומורפולוגיה מורכבת (באמצעות Vaa3D). האסטרטגיה הצבעונית המוצגת בפירוט כאן היא שיטה נוחה וחזקה המעניקה גישה מהירה וקלה למשטח האסטרוציטים הקליפתיים והמורפולוגיה בעכברים מסוג בר בשלבים התפתחותיים שונים, וקל להסתגלה לחקירת תכונות אנטומיות אסטרוציטים במודלים של עכברים של מחלות נוירולוגיות מבלי להשתמש בקווי כתב מהונדסים.