Pneumografia impedibile per la misurazione minimamente invasiva della frequenza cardiaca negli invertebrati in fase avanzata
Summary
La misurazione della frequenza cardiaca durante una sfida termica fornisce informazioni sulle risposte fisiologiche degli organismi come conseguenza del cambiamento ambientale acuto. Utilizzando l’aragosta americana (Homarus americanus) come organismo modello, questo protocollo descrive l’uso della peografia impedibile come un approccio relativamente non invasivo e non letale per misurare la frequenza cardiaca negli invertebrati in fase avanzata.
Abstract
Le temperature negli oceani stanno aumentando rapidamente a causa dei cambiamenti diffusi nei climi mondiali. Poiché la fisiologia dell’organismo è fortemente influenzata dalla temperatura ambientale, questo ha il potenziale per alterare le prestazioni fisiologiche termiche in una varietà di organismi marini. Utilizzando l’aragosta americana (Homarus americanus) come organismo modello, questo protocollo descrive l’uso della pneografia impedibile per capire come le prestazioni cardiache negli invertebrati in fase avanzata cambiano sotto stress termico acuto. Il protocollo presenta una tecnica minimamente invasiva che consente la raccolta in tempo reale della frequenza cardiaca durante un esperimento di rampa della temperatura. I dati sono facilmente manipolabili per generare un grafico Arrhenius che viene utilizzato per calcolare la temperatura di rottura di Arrhenius (ABT), la temperatura alla quale la frequenza cardiaca inizia a diminuire con l’aumentare delle temperature. Questa tecnica può essere utilizzata in una varietà di invertebrati in fase avanzata (ad esempio, granchi, cozze o gamberetti). Anche se il protocollo si concentra esclusivamente sull’impatto della temperatura sulle prestazioni cardiache, può essere modificato per comprendere il potenziale per ulteriori fattori di stress (ad esempio, ipossia o ipercapnia) per interagire con la temperatura per influenzare le prestazioni fisiologiche. Pertanto, il metodo ha il potenziale per applicazioni ad ampio raggio per comprendere ulteriormente come gli invertebrati marini rispondono ai cambiamenti acuti nell’ambiente.
Introduction
Negli ultimi decenni, l’aumento dell’apporto di gas a effetto serra (ad esempio anidride carbonica, metano e protossido di azoto) nell’atmosfera ha portato a modelli diffusi di cambiamento ambientale1. Gli oceani del mondo stanno rapidamente riscaldando2,3, una tendenza che può avere gravi impatti sulla fisiologia dell’organismo. La temperatura influenza pesantemente i tassi fisiologici e gli organismi hanno un intervallo di temperatura ottimale per le prestazioni4,5,6. Come tale, gli individui possono incontrare difficoltà nel mantenere la corretta consegna di ossigeno ai tessuti come temperature allontanarsi al di fuori di questo intervallo. Questo ha il potenziale per portare a cali delle prestazioni aerobiche di fronte al riscaldamento delle temperature oceaniche5,7.
In un ambiente di laboratorio, un metodo per comprendere gli impatti fisiologici del cambiamento ambientale consiste nell’esaminare le prestazioni cardiache nel contesto dello stress termico. Questo fornisce informazioni su come l’esposizione alle condizioni di riscaldamento previste può alterare le curve di prestazioni5,6 così come il potenziale di plasticità di acclimatazione8. Una varietà di metodi sono stati implementati con successo per misurare in precedenza la frequenza cardiaca negli invertebrati marini. Tuttavia, molte di queste tecniche comportano la rimozione chirurgica o la manipolazione importante dell’esoscheletro e l’impianto prolungato dei dispositivi di misura9,10,11, che introduce ulteriore stress al soggetto del test e aumenta il tempo necessario per un recupero di successo prima della sperimentazione. Inoltre, le tecniche meno invasive (ad esempio, l’osservazione visiva, la videografia) possono essere limitate alle fasi della storia della vita precoce quando gli organismi possono essere completamente o semi-trasparenti12. Inoltre, ulteriori sfide possono essere presentate ai ricercatori che non sono esperti in metodologie più tecnologicamente avanzate (ad esempio, osservazioni tramite trasduttori a infrarossi o perfusione Doppler8,11).
Questo protocollo utilizza l’aragosta americana (Homarus americanus) come modello di invertebrato marino in fase avanzata per dimostrare l’uso della pemiografia impedibile per valutare i cambiamenti della frequenza cardiaca durante un esperimento di rampa della temperatura. La pneografia impedibile comporta il passaggio di una corrente elettrica oscillante (AC) attraverso due elettrodi posizionati su entrambi i lati del pericardio per misurare i cambiamenti di tensione come il cuore si contrae e si rilassa13,14. Questa tecnica è minimamente invasiva, in quanto impiega l’uso di piccoli elettrodi (cioè 0,10–0,12 mm di diametro) che vengono impiantati delicatamente appena sotto l’esoscheletro. Infine, fornisce valutazioni in tempo reale della frequenza cardiaca e della temperatura dell’acqua durante la rampa attraverso l’uso di un data logger.
Il protocollo fornisce anche istruzioni per il calcolo della temperatura di rottura di Arrhenius (ABT), la temperatura alla quale la frequenza cardiaca inizia a diminuire con l’aumento delle temperature13,15. L’ABT funge da indicatore non letale del limite termico di capacità nei soggetti che possono essere favoriti rispetto alla misurazione del massimo termico critico (CTmax, il limite superiore della funzione cardiaca5,6), poiché i limiti letali sono spesso estremi e raramente incontrati nell’ambiente naturale 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’uso della pneografia impeditrice per misurare i cambiamenti nella frequenza cardiaca degli invertebrati in fase avanzata durante un esperimento di rampa della temperatura. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci di laboratorio9,10,11 è che è minimamente invasiva e non comporta una grande manipolazione chirurgica dell’esoscheletro, riducendo così la quantità di tempo d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Paul Rawson per l’assistenza di laboratorio e il premio IIA-1355457 della National Science Foundation al Maine EPSCoR presso l’Università del Maine per i fondi per l’acquisto di attrezzature. Questo progetto è stato sostenuto dall’USDA National Institute of Food and Agriculture, numero di progetto Hatch MEO-21811 attraverso la Maine Agricultural and Forest Experiment Station, così come NOAA National Marine Fisheries Service Saltonstall Kennedy Grant #18GAR039-136. Gli autori ringraziano anche tre recensori anonimi per i loro commenti su una versione precedente di questo manoscritto. Maine Agricultural and Forest Experiment Station Numero di pubblicazione 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
References
- Stocker, T. F., et al. . Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. . Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life’s origins to the Anthropocene. , (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. . Biology of the Lobster: Homarus americanus. , (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , (2007).
- . . Prism8 Statistics Guide. , (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist’s view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography – a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
