प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभावित एंटीएपिप्टिक पदार्थों के लिए एक प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन उपकरण के रूप में महत्वपूर्ण मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करने के अंतिम लक्ष्य के साथ पुनः प्राप्त मानव हिप्पोकैम्पस ऊतक के परिवहन और तैयारी का वर्णन करता है।
मिर्गी दुनिया की आबादी के बारे में 1% को प्रभावित करता है और चल रहे दौरे के साथ-साथ अचानक मौत के लिए उच्च जोखिम के कारण जीवन की गुणवत्ता में गंभीर कमी की ओर जाता है। उपलब्ध उपचार विकल्पों की बहुतायत के बावजूद, लगभग 30% रोगी दवा प्रतिरोधी हैं। कई उपन्यास चिकित्सा पशु मॉडल का उपयोग कर विकसित किया गया है, हालांकि दवा प्रतिरोधी रोगियों की दर अनछुए रहता है । संभावित कारणों में से एक कृंतक मॉडल और मनुष्यों के बीच अनुवाद की कमी है, जैसे पशु मॉडल में मानव फार्मासियों का कमजोर प्रतिनिधित्व। एक पूर्व नैदानिक मूल्यांकन उपकरण के रूप में मानव मस्तिष्क ऊतक को फिर से उठाया इस अनुवाद अंतर को पाटने के लिए लाभ है। यहां वर्णित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की उच्च गुणवत्ता की तैयारी और मिर्गी गतिविधि के बाद स्थिर प्रेरण के लिए एक विधि है। प्रोटोकॉल में 8 एमएमएम केसीएल और 4-अमीनोपिरिन के आवेदन के दौरान फट गतिविधि को शामिल करने का वर्णन किया गया है। यह गतिविधि स्थापित एईड लैकोसमाइड या उपन्यास एंटीपाइप्टिक उम्मीदवारों, जैसे डाइमेथाइलेथेनथेनमाइन (डीएमईए) के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, विधि एक्सट्रासेलुलर एमजी2 + और बाइकक्यूलिन, एक गाबाए रिसेप्टर अवरोधक के आवेदन में कमी करके मानव हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस के CA1 में जब्ती जैसी घटनाओं को शामिल करने का वर्णन करती है। प्रयोगात्मक सेट-अप का उपयोग मिर्गी गतिविधि पर उनके प्रभाव के लिए संभावित एंटीपाइप्टिक पदार्थों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट यौगिकों के लिए पोस्ट किए गए कार्रवाई के तंत्र को मानव ऊतक में इस दृष्टिकोण का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके)। समाप्त करने के लिए, महत्वपूर्ण मानव मस्तिष्क ऊतक पूर्व वीवो की जांच (यहां, लौकिक पालि मिर्गी से पीड़ित रोगियों से हिप्पोकैम्पस को पुनः प्राप्त किया गया) मानव मस्तिष्क में शारीरिक और रोग तंत्र के वर्तमान ज्ञान में सुधार करेगा।
मिर्गी दुनिया की आबादी के 1% को प्रभावित करने वाले सबसे आम न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक है, और बढ़ी हुई रुग्णता और मृत्यु दर1,,2से जुड़ा हुआ है। दुर्भाग्य से, मिर्गी से पीड़ित रोगियों में से एक तिहाई दवा प्रतिरोधी हैं, 20 से अधिक अनुमोदित एंटीएपिप्टिक दवाओं (AEDs)3सहित उपलब्ध उपचार विकल्पों की एक बहुतायत के बावजूद । पूर्व नैदानिक पशु अनुसंधान से नैदानिक परीक्षणों के लिए परिणामों का अनुवाद करने में विफलता एक कारण है कि कई रोगियों में आशाजनक उपचार रणनीतियां प्रभावी नहीं हैं4. हाल ही में, न्यूरोपेप्टाइड वाई (एनपीआई) और गैलेनिन को पशु मॉडलों में एंटीपाइप्टिक प्रभाव दिखाया गया है; हालांकि, जब पुनर्जीवित मानव मस्तिष्क ऊतक में परीक्षण किया, केवल NPY प्रभावी5था .
मौजूदा बुनियादी तंत्रिका विज्ञान तंत्र और रोग चिकित्सा दृष्टिकोण दृष्टिकोण के विषय में ज्ञान के अधिकांश पशु मॉडल और सेल संस्कृति प्रयोगों से स्टेम । हालांकि जानकारीपूर्ण, इन मॉडलों केवल जटिल मानव रोगों और वयस्क मानव मस्तिष्क नेटवर्क के एक पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । वैकल्पिक रूप से, मानव मस्तिष्क ऊतक में ट्रांसलेशनल गैप को पाटने की क्षमता है लेकिन कार्यात्मक अध्ययन के लिए शायद ही कभी उपलब्ध है। उदाहरण के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति, मस्तिष्क आकृति विज्ञान, या शारीरिक कनेक्शन की जांच करने में पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक एक मूल्यवान उपकरण रहा है, हालांकि न्यूरोनल गतिविधि अक्सर समझौता किया जाता है यह ऊतक6,,7,,8,,9,10, 11,11है।,
इसके विपरीत, जीवित पुनः प्राप्त मानव मस्तिष्क के ऊतकों की जांच प्रीक्लिनिकल दवा मूल्यांकन, बुनियादी न्यूरोनल कार्यों और जीन,अभिव्यक्ति पैटर्न12, 13,14,,,15,,16,,17से संबंधित की गई है ।17 कृंतक स्लाइस की तुलना में मानव मस्तिष्क स्लाइस का एक बड़ा लाभ रीसेक्शन और तैयारी के बाद न्यूरोनल ऊतक की लंबी व्यवहार्यता है। कृंतक मस्तिष्क स्लाइस की तुलना में, जिसे आमतौर पर तैयारी के बाद 8 घंटे तक दर्ज किया जा सकता है, मानव मस्तिष्क स्लाइस 72 घंटे तक के लिए स्थिर न्यूरोनल गतिविधि दिखाते हैं, जिससे इन दुर्लभ और मूल्यवान नमूनों की पूरी जांच को सक्षम किया जाता है12,,18।
कई अध्ययनों ने पुनः प्राप्त कॉर्टिकल और हिप्पोकैम्पस मानव ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में मिर्गी गतिविधि के गुणों की जांच की है और मिर्गी गतिविधि को शामिल करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया है। कृंतक स्लाइस में, मिर्गी गतिविधि को कई तरीकों से प्रेरित किया जा सकता है: डीजी हिलर कोशिकाओं की विद्युत उत्तेजना, बाह्य के+ (8-12 mM KCl) की वृद्धि, बाइकक्यूक्लिन (बीआईसी) द्वारा गाबाए रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करना, पोटेशियम चैनलों को 4-अमीनोपीरिडीन (4-एपी) द्वारा अवरुद्ध करना, और अतिरिक्त समाधानमें2 + को हटाना या कम करना। तथापि, मानव ऊतक में मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने के लिए उपरोक्त विधियों में से कम से कम दो के संयोजन की आवश्यकता होती है20,21,22.
यहां प्रस्तुत मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए एक विधि है, जो 20 घंटे तक के लिए व्यवहार्य हैं और उच्च K+ (8 mM) और 4-एपी या कम एमजी2 + और बीआईसी के आवेदन पर मिर्गी के रूप गतिविधि के शामिल दिखाने के लिए ।
जीवित पुनः प्राप्त मानव मस्तिष्क ऊतक AEDs के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन में एक अत्यधिक मूल्यवान उपकरण है, क्योंकि यह ठीक से एक अक्षुण्ण मानव मस्तिष्क माइक्रो नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऊतक परिवहन और तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो उच्च गुणवत्ता वाले हिप्पोकैम्पस स्लाइस के साथ-साथ एईड मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण मिर्गी गतिविधि के लिए एक स्थिर प्रेरण विधि सुनिश्चित करता है।
मिर्गी की गतिविधि की जांच के साथ – साथ मानव मस्तिष्क के स्लाइस में रासायनिक या विद्युत प्रेरण के तरीकों की जांच पहले अन्य समूहोंद्वारा 17, 20,21,2221को22दिखाई गई है । यह प्रोटोकॉल उच्च के+ +4-एपी के आवेदन के माध्यम से विभिन्न रोगियों से स्लाइस में स्थिर फट गतिविधि के शामिल होने के साथ-साथ कम एमजी2 + +बीआईसी के आवेदन के माध्यम से CA1 क्षेत्र में SLEs के शामिल होने का वर्णन करता है । यह पाया गया कि फट गतिविधि का प्रेरण SLEs (एक रोगी में परीक्षण स्लाइस का 50%) के शामिल होने की तुलना में अधिक सुसंगत है (15 रोगियों में परीक्षण स्लाइस का 80%)। हालांकि, इस प्रकार अब तक, SLEs के शामिल केवल एक मरीज में परीक्षण किया गया है । फिर भी, कम एमजी2 + +बीआईसी द्वारा SLEs के शामिल करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि SLEs अभी तक उच्च कश्मीर+ ++ 4-एपी का उपयोग करके प्रेरित नहीं किया जा सका है ।
कई अध्ययनों ने मानव मस्तिष्क के ऊतकों के परिवहन और तैयारी के तरीके शुरू किए हैं और अक्सर न्यूरोनल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण तीन कारकों को उजागर करते हैं: परिवहन समय, परिवहन समाधान का उपयोग किया जाता है, और शर्तों का भंडारण होता है।
इष्टतम टुकड़ा व्यवहार्यता के लिए, कुछ समूहों का सुझाव है कि पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतक के परिवहन के रूप में संभव के रूप में कम हो । हालांकि, ऑपरेशन रूम और प्रयोगशालाएं शायद ही कभी निकटता में होती हैं, जिसका अर्थ है कि स्लाइस गुणवत्ता को लंबे परिवहन के कारण समझौता किया जा सकता है। कुछ समूहों ने परिवहन12के दौरान समाधान के लिए निरंतर O2 लागू करके इस बाधा को दूर किया है । हमने परिवहन के दौरान लगातार अतिरिक्त ओ2 आपूर्ति के बिना कम (अधिकतम = 15 मिनट) और लंबी (1 घंटे तक) अवधि के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को ले जाया है, जो अन्य समूहों18,,25के समान है। इन मामलों में, मिर्गी रिकॉर्डिंग के दौरान ऊतक की गुणवत्ता में अंतर नहीं देखा गया था। हमारे संस्थान में अन्य समूहों के साथ संचार में, स्लाइस गुणवत्ता पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए नहीं बदली, या तो। इसके विपरीत, ऊतक की गुणवत्ता में भिन्नता संभवतः संचालन, लंबे समय तक पुनर्सेक्शन और स्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान नुकसान से उपजी है।
परिवहन और काटने के समाधान के संबंध में, सभी प्रकाशित तरीके एनएसीएल को ओएस्मोटिक दबाव के कारण कोशिका सूजन को कम करने के लिए समाधानों से छोड़ देते हैं, जो कृंतक पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए मानक प्रक्रिया के समान होते हैं। हालांकि, अब तक कई विकल्प पेश किए गए हैं (यानी सुक्रोज आधारित एसीसीएफ13,,22,एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ12,,26और कोलीन आधारित एसीएसएफ27)। टिंग और सहयोगियों ने 201426 में स्लाइस तैयारी के लिए एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ पेश किया और बाद में एक रिकवरी प्रोटोकॉल जोड़ा, जो धीरे-धीरे एनएसीएल को स्लाइस28में फिर से पेश करता है। हालांकि, जैसा कि टिंग एट अल द्वारा वर्णित है, एनएमडीजी-आधारित aCSF में तैयार मस्तिष्क ऊतक के न्यूरॉन्स उच्च झिल्ली प्रतिरोध दिखाते हैं, इस प्रकार पैच-क्लैंप प्रयोगों26के दौरान पूरे सेल सील को प्रभावित करते हैं। इसलिए, हमने एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ से कोलीन-आधारित एसीएसएफ20के उपयोग में संक्रमण किया है, जो क्षेत्र की क्षमता और पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस पैदा करता है।
स्लाइस के भंडारण के संबंध में, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि इंटरफ़ेस की स्थिति लंबे स्लाइस अस्तित्व18के लिए महत्वपूर्ण इष्टतम ऑक्सीजन प्रदान करती है। हालांकि, अन्य समूह जलमग्न परिस्थितियों में 72 घंटे तक के लिए स्लाइस अस्तित्व दिखाते हैं12। पिछली परिकल्पना के विपरीत, मानव मस्तिष्क स्लाइस कृंतक स्लाइस की तुलना में कम ऑक्सीजन या ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए अधिक प्रतिरोधी प्रतीत होते हैं। मुख्य रूप से, इंटरफ़ेस कक्षों का उपयोग पहले मानव हिप्पोकैम्पल स्लाइस के भंडारण के लिए किया गया है, हालांकि पैच-क्लैंप प्रयोगों में मानव मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए जलमग्न स्थितियों की सिफारिश की जाती है।
जैसा कि अन्य समूहों द्वारा चर्चा की गई है, लंबे स्लाइस सर्वाइवल (इंटरफ़ेस फॉर &48 एच18,के लिए जलमग्न <72 h12)के लिए एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम बैक्टीरियल संदूषण की रोकथाम है। कृंतक मस्तिष्क स्लाइस आमतौर पर 8 घंटे तक के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में उपयोग किए जाते हैं, और इस अवधि के दौरान बैक्टीरियल संदूषण को स्लाइस व्यवहार्यता को प्रभावित करने के लिए नहीं माना जाता है। एक resection से तैयार स्लाइस की उच्च संख्या और मानव मस्तिष्क ऊतक की असामान्य उपलब्धता मानव मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता को लम्बा करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया । यह विधि सफलतापूर्वक जीवित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी का वर्णन करती है, जिसे आसानी से बाँझ स्थितियों के अनुकूल किया जा सकता है। हालांकि, यहां प्रदर्शन की रिकॉर्डिंग के लिए, स्लाइस अस्तित्व 20 एच का विस्तार एक प्राथमिकता नहीं थी ।
एसएलएस22जैसी मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने के लिए इंटरफेस कक्षों में रिकॉर्डिंग भी आवश्यक दिखाई गई है । कम ऑक्सीजन के कारण जलमग्न स्थितियों, शायद ही कभी SLEs की रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, वे पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए आवश्यक ऑप्टिकल उच्च संकल्प के लिए आवश्यक हैं। एक अनुकूलित जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष का उपयोग उच्च ऑक्सीजन और तेजी से दवा आवेदन29के कारण, मानव मस्तिष्क स्लाइस में मिर्गी गतिविधि (बाह्य क्षेत्र या एकल न्यूरॉन) की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यहां, क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के लिए तरीकों और परिणामों का वर्णन किया जाता है, लेकिन इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि इस संशोधित रिकॉर्डिंग कक्ष (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके माउस और मानव मस्तिष्क स्लाइस में पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक की गई है।
कृंतक मॉडल की तुलना में मानव मस्तिष्क के ऊतकों का पुनर्संरस्रीय मूल्य अधिक होता है। यह एक वयस्क, रोगग्रस्त न्यूरोनल नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है जिसे आईपीएससी द्वारा पुन: पेश नहीं किया जा सकता है। हालांकि, किसी भी इन विट्रो सिस्टम की तरह, मानव मस्तिष्क स्लाइस एक अक्षुण्ण मानव मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतक के रिकॉर्ड किए गए न्यूरोनल नेटवर्क ऑपरेशन या तैयारी के दौरान नुकसान के कारण पर्याप्त आणविक और कार्यात्मक परिवर्तनों से गुजर सकते हैं। टुकड़ा करने की प्रक्रियाओं को गाबैर्जिक कार्य को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और मिर्गी की गतिविधि30को शामिल करने पर प्रभाव पड़ सकता है । परिकल्पना तैयार करते समय इन सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। संभावित एंटीएपिप्टिक दवाओं का परीक्षण करते समय, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि सभी मानव मस्तिष्क क्षेत्रों या सभी रोगियों में दवा लक्ष्य व्यक्त नहीं किए जा सकते हैं। विशेष रूप से, TLE रोगियों के हिप्पोकैम्पी अक्सर गंभीर न्यूरोनल सेल हानि के साथ हिप्पोकैम्पल स्क्लेरोसिस के लक्षण दिखाते हैं। रोग परिवर्तन और रोग के इतिहास पर रोगी की जानकारी प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है, जैसे दवाओं के प्रति संभावित रिफ्रैक्टरी, और डेटा व्याख्या के दौरान इस पर विचार करें।
अंत में, यह विधि सफलतापूर्वक दो अलग-अलग प्रकार की मिर्गी गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए जीवित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस और प्रेरण तकनीकों की तैयारी का वर्णन करती है। चूंकि जीवित मानव मस्तिष्क ऊतक की उपलब्धता दुर्लभ है, इसलिए मानव मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके प्रयोगों से अधिकतम उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित परिवहन और रिकॉर्डिंग शर्तों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह सुझाव दिया जाता है कि मानव मस्तिष्क ऊतक को कृंतक मॉडल और सेल संस्कृति प्रयोगों के अलावा एक प्रीक्लीनिकल सत्यापन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मैंडी मार्बलर-पोटर (चार्नाइट-अनवर्सिट्समेडिन, बर्लिन) का शुक्रिया अदा करते हैं। पीएफ को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति-EXC-2049-390688087 के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेस्चैफ्ट) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । इस काम को बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ में बायोमेडिकल रिसर्च को बदलने के लिए क्वेस्ट सेंटर द्वारा समर्थित किया गया है ।
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |