Двойной в утробе электропорации для целевой временно и пространственно отделенных популяций клеток

Кора головного мозга является очень сложной и замысловато организованной структурой. Для достижения такой степени организации, корковые проекционные нейроны проходят через сложные процессы развития, которые требуют их временного поколения, миграции к конечному пункту назначения в корковой пластине, и создания коротких и дальних соединений^1,2. Долгое время классический способ изучения кортикогенеза основывался на использовании нокаут-или стук-в мурин модели генов, представляющих интерес. Тем не менее, эта стратегия, и в частности использование условного нокаут мышей, занимает много времени и дорого, а иногда и создает дополнительные проблемы, связанные с существованием генетической избыточности или отсутствие конкретных драйверов CRE, среди других вопросов. Один из подходов, которые возникли, чтобы попытаться решить эти проблемы, и что в настоящее время широко используется для изучения коркового развития в утробе^{электропорации 3,4}. В утробе электропорации является метод, используемый для соматического трансгенеза, что позволяет in vivo ориентации нервных стволовых клеток и их потомства. Этот метод может быть использован для обозначения клеток по выражению флуоресцентных белков^5,,6, для манипуляции генами in vivo (т.е. получить или потерю функциональных анализов)^7,8,9, для изоляции электропорированных кортиков в пробирке и культивирования клеток^8,10.^, Кроме того, в утробе электропорации допускается временное и региональное управление целевым районом. Этот метод имеет многочисленные применения и широко используется для изучения нейронной миграции, деления стволовых клеток, нейронной связи, и другие предметы^8,9,11,12.

Нынешняя рукопись описывает использование в утробе электропорации вариант, называется двойной в утробе электропорации, для анализа взаимодействий клеток в коре головного мозга с различными височных и пространственных происхождения. Эти исследования чрезвычайно сложны для завершения при использовании моделей мурина, поскольку они требуют комбинированного использования нескольких трансгенных линий. Некоторые из применений протокола, описанного в настоящем документе, включают изучение тесных взаимодействий между соседними клетками, а также взаимодействия между удаленными клетками через долгосрочные проекции. Метод требует выполнения двух независимых в утробе электропорации операций, разделенных временно и пространственно, на одних и тех же эмбрионов для целевой различных групп клеток, представляющих интерес. Преимуществом такого подхода является возможность манипулирования функцией генов в одном или обоих типах нейронов с использованием диких животных типа. Кроме того, эти функциональные эксперименты могут быть объединены с выражением цитоплазматических или мембранных флуоресцентных белков для визуализации тонкой морфологии целевых клеток, включая дендритов и аксонов, и анализировать возможные различия в клеточных взаимодействиях по сравнению с контролем (т.е. клетки, помеченные только флуоресцентным белком).

Протокол, очерченный здесь, сосредоточен на изучении клеточных взаимодействий внутри неокортекса, но эта стратегия может также быть использована для изучения взаимодействий с внекортикальными областями, которые могут быть направлены с помощью электропорации внутриутробности, как подпаллий или таламус^13,,14, или клеточно-клеточных взаимодействий в других структурах, таких как мозжечок^15. Ориентация на различные области основана на ориентации электродов и на желудочке, где впрыскивается ДНК (боковая, третья или четвертая). При описанной здесь стратегии мы можем обозначить значительное количество ячеек, что полезно для оценки общих изменений в подключении/иннервации в функциональных экспериментах. Тем не менее, для изучения мелких изменений в подключении, можно использовать модифицированные версии в электропорации матки, чтобы получить разреженную маркировку и определить одиночные клетки^16. Таким образом, двойное в утробе электропорации является универсальным методом, который позволяет ориентации временно и пространственно разделенных популяций клеток и изучение их взаимодействия в деталях, либо в условиях контроля или в сочетании с функциональными экспериментами, значительно снижая временные и экономические затраты.