Vereinfachte Reverse Genetics-Methode zur Wiederherstellung rekombinanter Rotaviren, die Reporterproteine ausdrücken

Rotaviren sind Hauptursachen für schwere Gastroenteritis bei Säuglingen und Kleinkindern, sowie bei vielen anderen Säugetier- und Vogelarten¹. Als Mitglieder der Reoviridae-Familie haben Rotaviren ein segmentiertes doppelsträngiges RNA-Genom (dsRNA). Die Genomsegmente sind in einem nicht umhüllten ikosaedralen Virion enthalten, das aus drei konzentrischen Schichten des Proteins²gebildet wird. Basierend auf der Sequenzierung und phylogenetischen Analyse der Genomsegmente wurden neun Arten von Rotavirus (A-D, F-J) definiert³. Die Stämme, die Rotavirus-Arten A umfassen, sind für die überwiegende Mehrheit der menschlichen Krankheit verantwortlich⁴. Die Einführung von Rotavirus-Impfstoffen in Impfprogramme für Kinder, die in den letzten zehn Jahren begonnen haben, korreliert mit einer signifikanten Verringerung der Sterblichkeit und Morbidität von Rotavirus. Vor allem ist die Zahl der Rotavirus-assoziierten Todesfälle im Kindesalter von etwa 528.000 im Jahr 2000 auf 128.500 im Jahr 2016^{gesunken 4,5}. Rotavirus-Impfstoffe werden aus lebenden abgeschwächten Stämmen des Virus formuliert, wobei 2 bis 3 Dosen kindern im Alter von 6 Monaten verabreicht werden. Die große Anzahl genetisch unterschiedlicher Rotavirusstämme, die bei Menschen und anderen Säugetierarten zirkulieren, in Verbindung mit ihrer Fähigkeit, sich durch Mutagenese und Neusortierung schnell zu entwickeln, können zu antigenen Veränderungen in den Arten von Rotaviren führen, die Kinder^6,7,8infizieren. Solche Änderungen können die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe untergraben, die deren Ersatz oder Änderung erfordern.

Die Entwicklung vollständig plasmidbasierter Reverse-Genetik-Systeme, die die Manipulation eines der 11 Rotavirus-Genomsegmente ermöglichen, wurde erst vor kurzem erreicht⁹. Mit der Verfügbarkeit dieser Systeme ist es möglich geworden, molekulare Details der Rotavirusreplikation und Pathogenese zu entwirren, verbesserte Hochdurchsatz-Screening-Methoden für Anti-Rotavirus-Verbindungen zu entwickeln und neue potenziell effektivere Klassen von Rotavirus-Impfstoffen zu schaffen. Während der Rotavirus-Replikation leiten gekappte virale (+)RNAs nicht nur die Synthese viraler Proteine, sondern dienen auch als Vorlagen für die Synthese von Nachkommen dsRNA-Genomsegmenten^10,11. Alle bisher beschriebenen Rotavirus-Reverse-Genetik-Systeme stützen sich auf die Transfektion von T7-Transkriptionsvektoren in Säugetierzelllinien als Quelle von cDNA-abgeleiteten (+)RNAs, die bei der Wiederherstellung rekombinanter Viren^9,12,13verwendet werden. Innerhalb der Transkriptionsvektoren werden virale cDNAs in voller Länge zwischen einem vorgelagerten T7-Promotor und einem nachgeschalteten Hepatitis-Delta-Virus (HDV)-Ribozym positioniert, so dass virale (+)RNAs durch T7-RNA-Polymerase synthetisiert werden, die authentische 5′ und 3′-termini enthalten (Abbildung 1A). Im Reverse-Genetik-System der ersten Generation wurden rekombinante Viren durch Transfizierung von Babyhamster-Nierenzellen hergestellt, die T7-RNA-Polymerase (BHK-T7) mit 11 T7 (pT7) Transkriptionsvektoren exdrücken, jede direkte Synthese einer einzigartigen (+)RNA des simians SA11-Virusstamms und drei CMV-Promotor-Antriebsexpressionsplasmiden, eines kodiert das Aviäre Reovirus p10FAST-Fusionsprotein und zwei kodierende Untereinheiten des Impfvirus D1R-D12L-Verschluss-Enzymkomplexes⁹. Rekombinante SA11-Viren, die in transfizierten BHK-T7-Zellen erzeugt wurden, wurden durch Übersaat mit MA104-Zellen verstärkt, einer Zelllinie, die für das Wachstum des Rotavirus freiist. Es wurde eine modifizierte Version des Reverse-Genetik-Systems der ersten Generation beschrieben, die keine Unterstützungplasmide mehr verwendet¹². Stattdessen erzeugt das modifizierte System erfolgreich rekombinante Rotaviren, indem es BHK-T7-Zellen mit den 11 SA11 T7 Transkriptionsvektoren transfiziert, wobei der Vorbehalt besteht, dass Vektoren für die Bausteine der viralen Fabrik (Viroplasma) (nichtstrukturelle Proteine NSP2 und NSP5) auf Ebenen hinzugefügt werden, die 3-fach höher sind als die anderen Vektoren^14,15. Modifizierte Versionen des Reverse-Genetik-Systems wurden auch entwickelt, die die Wiederherstellung der menschlichen KU- und Odelia-Stämme des Rotavirus^16,17unterstützen. Das Rotavirus-Genom ist bemerkenswert anfällig für Manipulationen durch umgekehrte Genetik, mit rekombinanten Viren, die bisher mit Mutationen in VP4^18,NSP1⁹, NSP2¹⁹, NSP3^20,21und NSP5^22,23eingeführt wurden. Zu den nützlichsten Viren, die bisher erzeugt wurden, gehören diejenigen, die entwickelt wurden, um fluoreszierende Reporterproteine (FPs)^{auszudrücken 9,12,21,24,25}.

In dieser Publikation stellen wir das Protokoll für das Reverse-Genetik-System zur Verfügung, das wir in unserem Labor verwenden, um rekombinante Stämme von SA11-Rotavirus zu erzeugen. Das Hauptmerkmal unseres Protokolls ist die Ko-Transfektion von BHK-T7-Zellen mit den 11 pT7 Transkriptionsvektoren (modifiziert um 3x Ebenen des pT7/NSP2SA11 und pT7/NSP5SA11-Vektors) und eines CMV-Expressionsvektors, der das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) NP868R-Verschlussenzym²¹ (Abbildung 2) kodiert. In unseren Händen führt das Vorhandensein des NP868R-Plasmids zur Produktion von höheren Tittern rekombinanter Viren durch transfizierte BHK-T7-Zellen. In dieser Publikation stellen wir auch ein Protokoll zur Änderung des pT7/NSP3SA11-Plasmids bereit, so dass rekombinante Viren erzeugt werden können, die nicht nur das Segment 7-Proteinprodukt NSP3, sondern auch ein separates FP ausdrücken. Dies wird erreicht, indem der NSP3-Leserahmen (ORF) im pT7/NSP3SA11-Plasmid neu gestaltet wird, um ein nachgeschaltetes 2A-Translational Stop-Restart-Element gefolgt von einem FP ORF (Abbildung 1B)^24,26. Durch diesen Ansatz haben wir rekombinante Rotaviren erzeugt, die verschiedene FpPs exdrücken: UnaG (grün), mKate (far-red), mRuby (rot), TagBFP (blau), CFP (cyan) und YFP (gelb)^24,27,28. Diese FP-exemitten Rotaviren werden ohne Löschung des NSP3 ORF hergestellt, wodurch Viren entstehen, von denen erwartet wird, dass sie eine vollständige Ergänzung funktionierender viraler Proteine kodieren.