아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.
Summary
팔미토일화는 가역적인 방식으로 표적 단백질의 시스테인 잔류물까지 16탄소 팔미네이트 모이티의 혼입을 수반한다. 여기서, 우리는 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS) 분석법을 설명하고, 마우스 뇌 용해액에 관심 있는 임의의 단백질의 팔미토일화 상태를 조사한다.
Abstract
시 냅 스 AMPA 수용 체의 수준에서 활동 의존 변경 (AMPARs) 후 층 내 밀도 (PSD) 학습 및 메모리에 대 한 세포 메커니즘을 나타내는 것으로 생각 된다. 팔미토일화는 AMPA-Rs, 보조 인자 및 시냅스 스캐폴드를 포함한 많은 시냅스 단백질의 국소화 및 기능을 활성 의존적 방식으로 조절합니다. 우리는 4개의 유전자의 시냅스 분화 유도한 유전자 (SynDIG1-4) AMPA와 연관되고 시냅스 강도를 통제하는 두뇌 특정 막 막 단백질을 인코딩하는 것을 확인했습니다. SynDIG1은 활성 의존적 흥분성 시냅스 개발에 중요한 병타-트랜스멤브레인 영역에서 위치하는 2개의 시스테인 잔기에서 191 및 192에 위치한다. 여기에서, 우리는 혁신적인 생화확적인 접근법, 아실-PEGyl 교환 젤 시프트(APEGS) 분석법을 기술하여, 관심 있는 단백질의 팔미토일화 상태를 조사하고 마우스 뇌 용해액에 있는 단백질의 SynDIG 제품군과 그 유용성을 입증한다.
Introduction
S-팔미토일화는 안정적인 막 연관성, 단백질 인신 매매 및 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 표적 단백질의 가역적 번역 후변형1. 그것은 팔미토일 아실 트랜스퍼 라제 (PAT) 효소에 의해 촉매 티오 에스터 링키지를 통해 시스테인 잔기에 16 탄소 팔미테 모티의 추가를 포함한다. 뇌의 많은 시냅스 단백질은 AMPA-Rs 및 PSD-95를 포함하는, 안정성, 국소화 및 기능2,,3,,4를조절하는 활성 의존적 방식으로 팔미토틸화된다. PSD-95와 같은 시냅스 스캐폴드와 보조 요인의 상호 작용을 통해 PSD에 있는 시냅스 AMPARs의 수준에 있는 변경은 시냅스 가소성을 기초로 합니다; 따라서, 시냅스 단백질의 팔미토일화 상태를 결정하는 방법은 시냅스 가소성의 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공한다.
이전에는 AMPARs5와연관된 뇌 특이적 막 간 단백질을 코딩하는 4개의 유전자(SynDIG1-4)의 SynDIG 제품군을 확인했습니다. 해리된 랫트 해마 뉴런에서 SynDIG1의 과발현 또는 노크다운은 각각 면역세포화학 및전기생리학을사용하여 검출된 바와 같이, AMPA-R 시냅스 크기 및 수 ~50%에 의해 증가 또는 감소한다. 우리는 아실-비오틴 교환(ABE) 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능을 조절하는 활성 의존적 방식으로 두 개의 보존된 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토틸화된다는 것을 입증하였다6. ABE 분석은 변형 및 후속 친화성 정제에 의해 보호 시스테인에 비오틴의 교환에 의존7. 여기서, 우리는 혁신적인 생화학적 접근법, 아실-PEGyl 교환 겔 시프트(APEGS)8분석8,9,10,,11,,12,친화성 정제를 필요로 하지 않고 대신 겔 이동성의 변화를 활용하여 관심 있는 단백질에 대한 수정 횟수를 결정한다., 프로토콜은 적합한 항체가 유효한 마우스 두뇌에서 내인성 막 단백질의 조사를 위해 기술됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전작에서는 ABE 분석서를 활용하여 SynDIG1이 안정성, 국소화 및 기능6을조절하는 활성 의존적 방식으로 보존된 두 개의 병치-막간 시스 잔류물(모든 SynDIG 단백질에서 발견)에서 팔미토화된다는 것을 입증했습니다. 한계는 ABE 분석이 절차의 마지막 단계로 아비딘 모에티에 공액 된 아가로즈 수지와의 친화정화가 필요하며, 이로 인해 정량적 분석이 복잡해지는 신호의 상당한 손실?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 APEGS 분석에 대한 조언과 입력K. 울프리 감사합니다. 이 연구 결과는 화이트홀 재단과 NIH-NIMH (1R01MH119347)에서 E.D.에 연구 보조금에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
