阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定，用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定
Summary
棕榈化需要以可逆的方式将16碳棕榈酰化物与靶蛋白的半胱氨酸残留物结合。在这里，我们描述了一种生化方法，即acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定，以研究小鼠脑水化剂中任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态。
Abstract
在脑后密度 （PSD） 中突触性 AMPA 受体 （AMPA） 水平的活动相关变化被认为是一种细胞机制的学习和记忆。棕榈化以活动相关的方式调节许多突触蛋白的定位和功能，包括AMPA-R、辅助因子和突触支架。我们确定了突触分化诱导基因（SynDIG）的四个基因系列（SynDIG1-4），编码与AmpARs关联并调节突触强度的特定于大脑的跨膜蛋白。SynDIG1 在位于并列跨膜区域位置 191 和 192 处的两个半胱氨酸残留物处进行棕榈酸酯化，对活动依赖性兴奋突触发育非常重要。在这里，我们描述了一种创新的生化方法，即acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定，以调查任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态，并证明其与小鼠脑水化中蛋白质的SynDIG家族的作用。
Introduction
S-掌上酸化是一种可逆的转化后靶蛋白，调节稳定的膜关联、蛋白质贩运和蛋白质-蛋白质相互作用1。它涉及通过棕榈酸乙酰乙酰转移酶（PAT）酶催化的硫化物链接，将16碳棕榈酸酶添加到半胱氨酸残留物中。大脑中的许多突触蛋白被棕榈酸化，包括AMPA-R和PSD-95，以活动依赖的方式调节稳定性、定位性和功能22，3，4。3,4通过辅助因素与突触支架（如 PSD-95）之间的相互作用，PSD 中突触性抗量系数水平的变化，导致突触可塑性;因此，确定突触蛋白的棕榈化状态的方法为突触可塑性机制提供了重要的见解。
之前，我们确定了SynDIG家族的四个基因（SynDIG1-4），编码与AmpARs5相关的大脑特异性跨膜蛋白。在分离的大鼠河马神经元中，SynDIG1的过度表达或击倒增加或减少，AMPA-R突触的大小和数量与使用免疫细胞化学和电生理学5检测到的+50%。我们利用acyl-生物素交换（ABE）测定法来证明SynDIG1在两种保存的共聚体-转膜细胞残留物（存在于所有SynDIG蛋白中）中，以活动相关的方式调节稳定性、定位性和功能6。ABE测定依赖于通过修饰和随后的亲和力纯化7保护的半胱氨酸的生物组。在这里，我们描述了一种创新的生化方法，acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定88，9，10，11，12，它不需要亲和力纯化，而是利用凝胶流动性的变化来确定感兴趣的蛋白质的修改次数。,9,10,11,12该协议被描述为研究小鼠大脑中的内源膜蛋白，适合其抗体。
Protocol
Representative Results
Discussion
在之前的工作中，我们利用 ABE 测定来证明 SynDIG1 在两种保存的共聚膜细胞残渣（存在于所有 SynDIG 蛋白质中）中以活动相关的方式进行棕榈酸化，以调节稳定性、定位性和功能6。一个限制是ABE测定需要亲和纯化与阿甘丝树脂结合作为程序的最后一步，导致信号的重大丢失，使定量分析复杂化。此外，ABE测定无法区分蛋白质是棕榈酸酯一次还是在多个地点。
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢K.Woolfrey对APEGS测定的建议和意见。这些研究由白厅基金会和NIH-NIMH（1R01MH119347）对E.D.的研究资助资助。
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
