İntrasisternal Enjeksiyon Ile Leptomeningeal Hücre Modifikasyonu İndüksiyonu
Summary
Biz kafatası stabilize edilebilir ucunda bir iğne bükülmüş bir intrasisternal enjeksiyon tarif, böylece altta yatan parankim hasar riskini ortadan kaldırarak. Bu yaklaşım, leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritalanması ve manipülasyonları ve beyin-omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılabilir.
Abstract
Burada özetlenen protokol, altta yatan parankimhasar riskini ortadan kaldırırken sarnıç magna yoluyla güvenli ve elle çözelti enjekte nasıl açıklanır. Daha önce yayınlanan protokoller dural yüzeyden maksimum 1-2 mm indirilmelidir düz iğneler kullanmanızı öneririz. Dural membran delindikten sonra dirençteki ani düşüş, iğnenin sabit bir pozisyonda tutulmasını zorlaştırır. Yöntemimiz, bunun yerine, kafatasının oksipital kemiğine karşı stabilize edilebilen bir iğne bükülür, böylece dural zarın delinmesi sonrasında şırınganın dokuya girmesini önler. Prosedür basit, tekrarlanabilir ve işletilen hayvanlarda uzun süreli rahatsızlık neden olmaz. İntrasisternal enjeksiyon stratejisini vasküler leptomeningeal hücrelerin genetik kader haritasını çıkarmak bağlamında tanımlıyoruz. Aynı teknik, ayrıca, nörogelişimle leptomeninglerin rolünün araştırılması ve bakteriyel menenjitin yayılması gibi çok çeşitli araştırma sorularını ele almak için, bu fenomenlere dahil olan genlerin genetik ablasyonyoluyla kullanılabilir. Ayrıca, prosedür sürekli teslimat için bir otomatize infüzyon sistemi ile kombine edilebilir ve floresan etiketli moleküllerin enjeksiyonu yoluyla beyin omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılır.
Introduction
Leptomeningeal hücreler, beyni büstü eden ve kollajen çapraz bağlama (örneğin, Dcn ve Lum)karıştığı genleri ifade eden ince bir tabaka halinde organize edilmiş ve beyin meningeal bariyerinin kurulmasında (örn. Cldn11)1,,2. Leptomeningeal hücreler fizyolojik fonksiyonların geniş bir yelpazede karıştığı, beyin omurilik sıvı drenaj üzerinde sıkı kontrol3 gelişmekte olan beyinde nöral atalarının rehberlikiçin 4,5. Yeni bir çalışma da yenidoğan leptomeningler beyin parankim içine göç ve fonksiyonel kortikal nöronlar6geliştirmek radyal glia benzeri hücreleri barındırabilir önerdi .
Leptomeningeal hücreler yüzey astrositleri yakın yer ve onlarla paylaşmak, yanı sıra diğer parenkimal astroglia, connexin-30 (Cx30)7ifadesi . Aşağıda özetlenen cerrahi işlem, transgenik farelerin sarnıca magna içine endoksifen bir kerelik teslim yoluyla bu menenjial hücrelerin yaygın ve spesifik etiketleme sağlar şartlı Cx30tdTomato ifade + hücreler (yani, kader haritalama için bir CreER-loxP sistemi kullanarak). Endoksifen Tamoksifen aktif bir metaboliti ve Tamoxifen yaptığı gibi creer ifade hücrelerinin rekombinasyon indükler. Ancak, yüksek etanol konsantrasyonları yerine %5-10 DMSO’da çözünde nedeniyle topikal uygulama için önerilen çözümdür. Ayrıca, endoksifen beyin-meningeal bariyeri geçmez, böylece leptomeningeal hücrelerin özel rekombinasyon sağlayan, altta yatan Cx30 etiketleme olmadan+ astroglial popülasyon (Temsili Sonuçlarbakınız).
Burada sunulan teknik, sarnıç magna doğrudan erişim yoluyla, beyin omurilik sıvısı bileşik el ile ve güvenli bir şekilde enjekte etmeyi amaçlamaktadır. Kraniyotomi gerektiren diğer, daha invaziv prosedürlerin aksine, Bu yaklaşım kafatası veya beyin parankim zarar vermeden bileşikler aşılamak için izin verir. Böylece, parankimal glia hücrelerinin aktivasyonu ile tetiklenen inflamatuar reaksiyonların indüksiyon uyruk ile ilişkili değildir. Önce açıklanan diğer enjeksiyon stratejileri benzer8,9,10, Mevcut yaklaşım sarnıç magna kapsayan atlanto-oksipital dural membran cerrahi maruz kalma dayanır, boyun kaslarının künt diseksiyon sonra. Ancak, diğer prosedürlerin aksine, biz uygulama sırasında oksipital kemik karşı stabilize edilebilir ucunda bükülmüş bir iğne kullanılmasını öneririz. Bu iğne çok derin nüfuz ve altta yatan beyincik ve medulla zarar riskini önleyecektir.
Bu cerrahi işlem, hücre kimliklerinde ve parankimal tabakalar yoluyla göç yollarındaki değişikliklerin haritalamasını amaçlayan soy izleme araştırmalarıyla uyumludur. Aynı zamanda sağlık ve hastalık leptomeningeal hücrelerin rolünü araştırmak niyetinde genetik ablasyon çalışmalara adapte edilebilir, kortikal gelişime katkıları gibi5 veya bakteriyel menenjit yayılması3,11. Son olarak, yaban tipi hayvanlarda floresan izleyicilerin teslimatı ile kombine edildiğinde beyin omurilik sıvısı hareketini izlemek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada özetlenen protokol, kader haritalaması için leptomeningeal hücreleri etiketlemek için basit ve tekrarlanabilir bir prosedür sunar. Biz endoksifen intrasisternal enjeksiyon kullanın, Tamoksifen aktif bir metaboliti, Cx30-CreER tdTomato floresan muhabiri ifade indüklemek için; R26R-tdDomatesfareleri 12,13.
Sarnıç magna9ile beyin-omurilik sıvısına erişim sağlamak için kullanılan diğer prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Kanser Derneği, İsveç Stratejik Araştırmalar Vakfı, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse ve Karolinska Institutet’te (StratRegen) Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Stratejik Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
