Induktion von Leptomeningealzellen Modifikation über intrazisternale Injektion
Summary
Wir beschreiben eine intrazisternale Injektion, die eine an der Spitze gebogene Nadel verwendet, die zum Schädel stabilisiert werden kann, wodurch das Risiko einer Schädigung des darunter liegenden Parenchyms beseitigt wird. Der Ansatz kann für die genetische Schicksalskartierung und Manipulation von Leptomeningealzellen und für die Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit verwendet werden.
Abstract
Das hier skizzierte Protokoll beschreibt, wie man Lösungen sicher und manuell durch die Zisterne magna injiziert und gleichzeitig das Risiko einer Beschädigung des zugrunde liegenden Parenchyms eliminiert. Zuvor veröffentlichte Protokolle empfehlen die Verwendung von geraden Nadeln, die von der Duraloberfläche auf maximal 1-2 mm abgesenkt werden sollten. Der plötzliche Rückgang des Widerstands, sobald die Duralmembran durchlöchert wurde, macht es schwierig, die Nadel in einer stabilen Position zu halten. Unsere Methode verwendet stattdessen eine an der Spitze gebogene Nadel, die gegen den okzipitalen Knochen des Schädels stabilisiert werden kann, wodurch verhindert wird, dass die Spritze nach perforation der Duralmembran in das Gewebe eindringt. Das Verfahren ist einfach, reproduzierbar und verursacht keine lang anhaltenden Beschwerden bei den operierten Tieren. Wir beschreiben die intrazisternale Injektionsstrategie im Kontext der genetischen Schicksalskartierung von vaskulären Leptomeningealzellen. Die gleiche Technik kann darüber hinaus verwendet werden, um eine breite Palette von Forschungsfragen zu beantworten, wie die Untersuchung der Rolle von Leptomeningen in der Neuroentwicklung und die Verbreitung von bakteriellen Meningitis, durch genetische Ablation von Genen, die angeblich in diese Phänomene involviert sind. Darüber hinaus kann das Verfahren mit einem automatisierten Infusionssystem für eine konstante Abgabe kombiniert und zur Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit durch Injektion fluoreszierender Moleküle verwendet werden.
Introduction
Leptomeningeale Zellen sind eine fibroblastenartige Population von Zellen, die in einer dünnen Schicht organisiert sind, die das Gehirn überlagert und Gene exzessiiert, die in kollagenvernetzung (z. B. Dcn und Lum) und bei der Etablierung einer Hirn-Meningealbarriere (z. B. Cldn11)1,2beteiligt sind. Leptomeningeale Zellen sind in eine breite Palette von physiologischen Funktionen involviert, von der strengen Kontrolle über die Zerebrospinalflüssigkeit Drainage3, um Führung der neuronalen Vorläufer im sich entwickelnden Gehirn4,5. Eine aktuelle Studie hat auch vorgeschlagen, dass Leptomeninges beim Neugeborenen radialgliaartige Zellen beherbergen können, die in das Gehirn parenchyma wandern und sich zu funktionellen kortikalen Neuronen entwickeln6.
Leptomeningealzellen befinden sich in unmittelbarer Nähe zu Oberflächenastrozyten und teilen sich mit ihnen, sowie andere parenchymale Astroglia, Expression von Connexin-30 (Cx30)7. Das unten beschriebene chirurgische Verfahren ermöglicht eine weit verbreitete und spezifische Kennzeichnung dieser Meningealzellen über eine einmalige Abgabe von Endoxifen in die Zisternenmagna von transgenen Mäusen, die tdTomato in Cx30+ Zellen konditionell ausdrücken (d. h. mit einem CreER-loxP-System zur Schicksalskartierung). Endoxifen ist ein aktiver Metabolit von Tamoxifen und induziert eine Rekombination von CreER-exezierenden Zellen auf die gleiche Weise wie Tamoxifen. Es ist jedoch die empfohlene Lösung für die topische Anwendung, da es sich in 5-10% DMSO auflöst, anstatt hohe Konzentrationen von Ethanol. Darüber hinaus überschreitet Endoxifen nicht die Hirn-Meningeal-Barriere und ermöglicht somit eine spezifische Rekombination von Leptomeningealzellen, ohne die zugrunde liegende Cx30+ astrogliale Population zu kennnieren (siehe Repräsentative Ergebnisse).
Die hier vorgestellte Technik zielt darauf ab, die Verbindung manuell und sicher in die Zerebrospinalflüssigkeit zu injizieren, über den direkten Zugang zur Zisterne magna. Im Gegensatz zu anderen, invasiveren Verfahren, die eine Kraniotomie erfordern, ermöglicht dieser Ansatz, Verbindungen zu infundieren, ohne schäden am Schädel oder am Hirnparenchym zu verursachen. Daher ist es nicht mit der Induktion von Entzündungsreaktionen verbunden, die durch die Aktivierung von parenchymalen Gliazellen ausgelöst werden. Ähnlich wie bei anderen Injektionsstrategien, die vor8,9,10beschrieben wurden, beruht der gegenwärtige Ansatz auf der chirurgischen Exposition der atlanto-okzipitalen Duralmembran, die die Zisterne magna bedeckt, nach stumpfer Zerlegung der überlagernden Nackenmuskulatur. Im Gegensatz zu anderen Verfahren empfehlen wir jedoch die Verwendung einer an der Spitze gebogenen Nadel, die während der Verabreichung gegen den okzipitalen Knochen stabilisiert werden kann. Dadurch wird verhindert, dass die Nadel zu tief eindringt und das darunter liegende Kleinhirn und die Medulla beschädigt.
Dieses chirurgische Verfahren ist kompatibel mit Linienverfolgungsuntersuchungen, die darauf abzielen, Veränderungen in Zellidentitäten und Migrationsrouten durch parenchymale Schichten zu kartieren. Es kann auch an genetische Ablationsstudien angepasst werden, die die Rolle von Leptomeningealzellen bei Gesundheit und Krankheit untersuchen wollen, wie ihren Beitrag zur kortikalen Entwicklung5 oder die Verbreitung von bakterieller Meningitis3,11. Schließlich kann es verwendet werden, um zerebrospinale Flüssigkeit Bewegung zu verfolgen, in Kombination mit der Lieferung von fluoreszierenden Tracern bei Wildtieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier skizzierte Protokoll stellt ein einfaches und reproduzierbares Verfahren zur Kennzeichnung von Leptomeningealzellen für die Schicksalskartierung dar. Wir verwenden die intrazisternale Injektion von Endoxifen, einem aktiven Metaboliten von Tamoxifen, um die Expression von tdTomato fluoreszierendem Reporter in Cx30-CreER zu induzieren; R26R-tdTomatenmäuse12,13.
Im Vergleich zu anderen Protokollen, die für den Zugang zur Zereb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Stipendien des Schwedischen Forschungsrats, der Schwedischen Krebsgesellschaft, der Schwedischen Stiftung für Strategische Forschung, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse und des Strategischen Forschungsprogramms für Stammzellen und Regenerative Medizin am Karolinska Institutet (StratRegen) unterstützt.
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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