Induction de modification des cellules leptomeningeales par injection intracisterale
Summary
Nous décrivons une injection intracisternale qui emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée au crâne, éliminant ainsi le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. L’approche peut être utilisée pour la cartographie du destin génétique et les manipulations des cellules leptoméningeales et pour le suivi du mouvement des fluides phériques.
Abstract
Le protocole décrit ici comment injecter des solutions en toute sécurité et manuellement par le biais de la cisterna magna tout en éliminant le risque de dommages au parenchyme sous-jacent. Les protocoles précédemment publiés recommandent d’utiliser des aiguilles droites qui devraient être abaissées à un maximum de 1-2 mm de la surface durale. La chute soudaine de résistance une fois que la membrane durale a été perforée rend difficile le maintien de l’aiguille dans une position stable. Notre méthode, au lieu, emploie une aiguille pliée à la pointe qui peut être stabilisée contre l’os occipital du crâne, empêchant ainsi la seringue de pénétrer dans le tissu après perforation de la membrane durale. La procédure est simple, reproductible, et ne cause pas d’inconfort durable chez les animaux opérés. Nous décrivons la stratégie d’injection intracisternale dans le contexte de la cartographie génétique du destin des cellules leptomeningeal vasculaires. La même technique peut, en outre, être utilisée pour répondre à un large éventail de questions de recherche, telles que l’examen du rôle des leptomeninges dans le neurodéveloppement et la propagation de la méningite bactérienne, par ablation génétique des gènes impliqués dans ces phénomènes. En outre, la procédure peut être combinée avec un système d’infusion automatisé pour une livraison constante et utilisé pour le suivi du mouvement du liquide phébrospin par injection de molécules étiquetées fluorescentes.
Introduction
Les cellules leptoméningéales sont une population fibroblaste-like de cellules organisées dans une fine couche superposant le cerveau et exprimant des gènes impliqués dans le collagène crosslinking (par exemple, Dcn et Lum), et dans l’établissement d’une barrière cerveau-méningeal (par exemple, Cldn11)1,2. Les cellules leptomeningeal sont impliquées dans un large éventail de fonctions physiologiques, du contrôle strict sur le drainage de fluide céphalochental3 à la conduite des progéniteurs neuraux dans le cerveau en développement4,5. Une étude récente a également proposé que les leptomeninges chez le nouveau-né peuvent abriter des cellules radiales ressemblant à des gliax qui migrent dans le parenchyme du cerveau et se développent en neurones corticaux fonctionnels6.
Les cellules leptoméningéales sont situées à proximité des astrocytes de surface et partagent avec eux, ainsi que d’autres astroglias parenchymiques, expression de connexin-30 (Cx30)7. La procédure chirurgicale décrite ci-dessous permet l’étiquetage généralisé et spécifique de ces cellules méningées par l’intermédiaire d’une livraison ponctuelle d’endoxifène dans la cisterna magna des souris transgéniques exprimant conditionnellement tdTomato dans les cellules Cx30 (c.-à-d., en utilisant un système CreER-loxP pour la cartographie du destin).+ Endoxifen est un métabolite actif de Tamoxifen et induit la recombinaison des cellules exprimant creER de la même manière que Tamoxifen. Il est, cependant, la solution recommandée pour l’application topique, car il se dissout dans 5-10% DMSO, au lieu de fortes concentrations d’éthanol. En outre, l’endoxifène ne traverse pas la barrière cerveau-méningeal, permettant ainsi une recombinaison spécifique des cellules leptomeningéales, sans étiquetage de la population cx30 sous-jacenteet astroglial (voir résultats représentatifs).
La technique présentée ici vise à injecter manuellement et en toute sécurité le composé dans le liquide phérépinal, via un accès direct à la cisterna magna. Contrairement à d’autres procédures plus invasives nécessitant la craniotomie, cette approche permet d’infuser des composés sans causer de dommages au crâne ou au parenchyme cérébral. Ainsi, il n’est pas associé à l’induction des réactions inflammatoires déclenchées par l’activation des cellules parenchymales de glia. Semblable à d’autres stratégies d’injection décrites avant8,9,10, l’approche actuelle repose sur l’exposition chirurgicale de la membrane dural atlanto-occipital couvrant la cisterna magna, après dissection émoussée des muscles du cou supergel. Cependant, contrairement à d’autres procédures, nous recommandons l’utilisation d’une aiguille pliée à la pointe, qui peut être stabilisée contre l’os occipital pendant l’administration. Ceci empêchera le risque que l’aiguille pénètre trop profondément et endommage le cervelet et le medulla sous-jacents.
Cette intervention chirurgicale est compatible avec les recherches de traçage de la lignée qui visent à cartographier les changements dans les identités cellulaires et les itinéraires de migration à travers les couches parenchymales. Il peut également être adapté aux études d’ablation génétique qui ont l’intention de sonder le rôle des cellules leptoménageesales dans la santé et la maladie, telles que leur contribution au développement cortical5 ou la propagation de la méningite bactérienne3,11. Enfin, il peut être utilisé pour suivre le mouvement des fluides phégonaux lorsqu’il est combiné avec la livraison de traceurs fluorescents chez les animaux de type sauvage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici présente une procédure simple et reproductible pour étiqueter les cellules leptomeningeales pour la cartographie du destin. Nous utilisons l’injection intracisternale d’endoxifen, un métabolite actif de Tamoxifen, pour induire l’expression du journaliste fluorescent de tdTomato dans Cx30-CreER ; R26R-tdTomato souris12,13.
Par rapport à d’autres protocoles utilisés pour accéder au liquide phébros…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil suédois de la recherche, de la Société suédoise du cancer, de la Fondation suédoise pour la recherche stratégique, de Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse et du Programme stratégique de recherche en cellules souches et en médecine régénérative à l’Institut Karolinska (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
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