Inductie van Leptomeningeal Cellen Wijziging Via Intracisternal Injectie
Summary
We beschrijven een intracisternalinjectie die een naald gebruikt die aan de punt is gebogen en die kan worden gestabiliseerd aan de schedel, waardoor het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. De aanpak kan worden gebruikt voor genetische lot mapping en manipulaties van leptomeningealcellen en voor het bijhouden van cerebrospinale vloeistof beweging.
Abstract
Het hier beschreven protocol beschrijft hoe u veilig en handmatig oplossingen injecteren via de cisterna magna terwijl het risico op schade aan de onderliggende parenchyma wordt geëlimineerd. Eerder gepubliceerde protocollen raden het gebruik van rechte naalden die moeten worden verlaagd tot een maximum van 1-2 mm van het dural oppervlak. De plotselinge daling van de weerstand zodra het durale membraan is doorboord, maakt het moeilijk om de naald in een stabiele positie te houden. Onze methode, in plaats daarvan, maakt gebruik van een naald gebogen op de punt die kan worden gestabiliseerd tegen het occipital bot van de schedel, waardoor de spuit niet in het weefsel doordringt na perforatie van het durale membraan. De procedure is eenvoudig, reproduceerbaar en veroorzaakt geen langdurig ongemak bij de geopereerde dieren. We beschrijven de intracisternal injectiestrategie in de context van genetische fate mapping van vasculaire leptomeningealcellen. Dezelfde techniek kan bovendien worden gebruikt om een breed scala van onderzoeksvragen aan te pakken, zoals het onderzoeken van de rol van leptomeninges in neuroontwikkeling en de verspreiding van bacteriële meningitis, door genetische ablatie van genen putatief betrokken bij deze verschijnselen. Bovendien kan de procedure worden gecombineerd met een geautomatiseerd infusiesysteem voor een constante levering en worden gebruikt voor het volgen van cerebrospinale vloeistofbeweging via injectie van fluorescerende gelabelde moleculen.
Introduction
Leptomeningealcellen zijn een fibroblast-achtige populatie van cellen georganiseerd in een dunne laag die de hersenen overlegt en genen uitdrukt die betrokken zijn bij collageencrosslinking (bijvoorbeeld Dcn en Lum), en bij de oprichting van een hersen-meningeale barrière (bijvoorbeeld Cldn11)1,2. Leptomeningeale cellen zijn betrokken bij een breed scala van fysiologische functies, van strikte controle over de cerebrospinale vloeistof drainage3 tot begeleiding van neurale voorouders in de zich ontwikkelende hersenen4,5. Een recente studie heeft ook voorgesteld dat leptomeninges in de pasgeborene kan haven radiale glia-achtige cellen die migreren naar de hersenen parenchyma en ontwikkelen tot functionele corticale neuronen6.
Leptomeningealcellen bevinden zich in de nabijheid van oppervlakteastrocyten en delen met hen, evenals andere parenchymale astroglia, expressie van connexin-30 (Cx30)7. De onderstaande chirurgische procedure maakt een wijdverbreide en specifieke etikettering van deze meningealecellen mogelijk via een eenmalige levering van endoxifen in de cisterna magna van transgene muizen die tdTomato in Cx30+ cellen voorwaardelijk uitdrukken (d.w.z. met behulp van een CreER-loxP-systeem voor het in kaart brengen van het lot). Endoxifen is een actieve metaboliet van Tamoxifen en induceert recombinatie van CreER-uitdrukkende cellen op dezelfde manier als Tamoxifen doet. Het is echter de aanbevolen oplossing voor actuele toepassing, omdat het oplost in 5-10% DMSO, in plaats van hoge concentraties ethanol. Bovendien kruist endoxifen niet de hersen-meningeale barrière, waardoor een specifieke recombinatie van leptomeningeale cellen mogelijk wordt, zonder etikettering van de onderliggende Cx30+ astrogliale populatie (zie representatieve resultaten).
De hier gepresenteerde techniek is gericht op het handmatig en veilig injecteren van de verbinding in het hersenvocht, via directe toegang tot de cisterna magna. In tegenstelling tot andere, meer invasieve procedures die craniotomie vereisen, maakt deze aanpak het mogelijk om verbindingen te bezielen zonder schade aan de schedel of het brein parenchyma te veroorzaken. Het wordt dus niet geassocieerd met de inductie van ontstekingsreacties veroorzaakt door activering van parenchymale gliacellen. Net als bij andere injectiestrategieën beschreven vóór8,9,10, is de huidige aanpak gebaseerd op de chirurgische blootstelling van het atlanto-occipital dural membraan dat de cisterna magna bedekt, na een stompe dissectie van de overlopende nekspieren. Echter, in tegenstelling tot andere procedures, raden we het gebruik van een naald gebogen aan de punt, die kan worden gestabiliseerd tegen het occipital bot tijdens toediening. Dit voorkomt het risico dat de naald te diep doordringt en het onderliggende cerebellum en medulla beschadigt.
Deze chirurgische ingreep is compatibel met afstammingsonderzoeken die gericht zijn op het in kaart brengen van veranderingen in celidentiteiten en migratieroutes via haakjeslagen. Het kan ook worden aangepast aan genetische ablatiestudies die van plan zijn de rol van leptomeningealcellen in gezondheid en ziekte te onderzoeken, zoals hun bijdrage aan corticale ontwikkeling5 of de verspreiding van bacteriële meningitis3,11. Ten slotte kan het worden gebruikt om cerebrospinale vloeistof beweging te volgen in combinatie met de levering van fluorescerende tracers in wildtype dieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier geschetste protocol presenteert een eenvoudige en reproduceerbare procedure om leptomeningealcellen te labelen voor het in kaart brengen van het lot. We gebruiken intracisternalinjectie van endoxifen, een actieve metaboliet van Tamoxifen, om expressie van tdTomato fluorescerende reporter in Cx30-CreER te induceren; R26R-tdTomato muizen12,13.
In vergelijking met andere protocollen die worden gebruikt voor het verkrijgen van toe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Zweedse Onderzoeksraad, de Swedish Cancer Society, de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek, Knut en Alice Wallenbergs Stiftelse en het Strategic Research Programme in Stem Cells and Regenerative Medicine van Karolinska Institutet (StratRegen).
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
References
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
