혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

배아 신장의 오르가노티픽 배양은 수십 년 전^신발생을연구하는 중요한 모델이 되었다^1,2,,3. 신장 오르가노이드는 건강하고 병에 걸린 신장의 발달을 연구하기위한 고급 모델 시스템을 나타냅니다^4. 그러나 두 방법의 주요 단점은 두 방법 모두 신장의 주요 기능인 혈액 여과를 다시 요약하지 않는다는 것입니다. 네프론과 신장 혈관 구조는 생체 내 발달의 초기 단계와 유사하게 신장 오르가노이드 및 organotypic 문화에서 개발; 그러나, 시험관내에서 형성된 사구체는 avascular^5. 생체내 배아 신장 및 신장 오르가노이드의 혈관화는 생체내 조건 하에서만 이식 실험에서 이전에 입증되었다. 예를 들어, 마우스 신장 캡슐 하에 인간 다능성 줄기 세포 유래 신장 오르가노이드의 이식은 기능적 단계^6에오르가노이드에서 네프론의 발달을 허용한다.

순전히 생체외 배양과 생체 내 이식 방법 사이의 중간 접근법은 조류 배아의 CAM에 대한 이종이식이다. 그대로 마우스 신장 프리모르디아의 혈관화는 이전에 이 시스템을 사용하여 입증되었다^7,,8. 그러나, 또한, 이종이이식된 뮤린 신장에서의 신장 혈관구조는 이식편^9가아닌 숙주 내피로부터 유래된 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 실험 조건이 공여자 유래 내피 세포의 생존을 위해 허용되지 않기 때문에 신장 혈관구조의 개발을 연구하기 위해 배아 신장의 키메라(조류-포유류) 모델의 잠재력을 현저히 감소시켰습니다.

이 프로토콜의 첫 번째 부분에서 제시 조류 계란의 CAM에 마우스 배아 신장의 재배에 대 한 향상 된 방법, organotypic 문화와 이종 이식의 미세 환경 조건을 결합. 이전 방법의 주요 개선은 마우스 배아 신장과 신장 오르가노이드를 CAM에 직접 배치하는 대신 이식 된 조직을 공급하는 배양 배지로 채워진 투과성 미니 저장소로 겹쳐져 있다는 것입니다. 영양분과 함께 건조로부터 보호합니다. 실험의 성공률은 크게 증가하고 기증자 유래 혈관 구조의 개발을위한 조건이 향상됩니다. 이 방법을 이방법에서 이방법 으로 이식 배양하는 것은 공여자 신장으로부터 내인성 내피 세포로 구성된 사구체 혈관구조의 발달을 초래한다.

세포 형태 형성의 상세한 분석은 신장 문화 모형의 또 다른 중요한 응용입니다. 신장 배양의 타임랩스 이미지 획득의 이전에 보고된 방법은 배아 신장의 전반적인 형태 및 패터닝의 분석에만 충분하지만, 개별^{세포(10)를}추적하는 것은 아니다. 최근, 신장 오르가노이드 및 오르노티픽 배양의 고해상도 공초점 3D 타임랩스 영상을 겨냥한 새로운 고정 Z-Direction(FiZD) 방법을^{11개기하였다.} 이 방법에서, 오르가노이드와 배아 기관은 샘플의 두께가 70 μm에 도달 할 때까지 맞춤형 설계 플레이트에 트랜스 웰 삽입의 유리 커버 슬립과 투과성 멤브레인 사이에 부드럽게 압축되어 이미징을위한 최적의 광학 조건을 제공합니다. 방법의 두 번째 부분에서는, 장기 오르가노이드 화상 진찰을 위한 사용자 정의 디자인한 격판덮개 및 FiZD 실험의 설치를 위한 상세한 프로토콜이 기술됩니다.