التحسين من الكلين Organoid وOrganotypic الثقافة للعوعية ، التنمية الموسعة ، وتحسين التصوير المجهري
Summary
يصف هذا العمل طريقتين لدراسة تطور الأعضاء، إعداد زينوزراعة محسنة على الغشاء chorioallantoic (CAM) من أجنة الطيور التي تسمح لالأوعية الدموية من الأعضاء الجنينية المستزرعة وorganoids ورواية ثابتة z الاتجاه طريقة ثقافة الجهاز مع الشروط التجريبية المعدلة التي تسمح للتصوير البؤري الفاصل الزمني عالي الدقة.
Abstract
الثقافات الكلى الجنينية organotypic، وخاصة الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستمدة من الكلى الأعضاء، هي أدوات ممتازة لمتابعة العمليات التنموية ونمذجة أمراض الكلى. ومع ذلك، فإن النماذج محدودة بسبب نقص الأوعية الدموية والأداء الوظيفي. لمعالجة هذا، تم تطوير بروتوكول محسن لطريقة xenografting الخلايا والأنسجة إلى الغشاء chorioallantoic (CAM) لجنين الطيور للحصول على الأوعية الدموية واستعادة تدفق الدم. يتم تراكب الطعوم مع الخزانات الصغيرة المصنوعة حسب الطلب التي تقوم بإصلاح العينات إلى CAM وتزويدها بالوسط الثقافي الذي يحمي الطعوم من التجفيف. تسمح طريقة الثقافة المحسنة لـ xenografts بالنمو لمدة تصل إلى 9 أيام. كما تصف المخطوطة كيفية توفير الظروف المثلى للتصوير البؤري على المدى الطويل للعضويات الكلوية والثقافات الأورغنية باستخدام طريقة Z-Direction الثابتة (FiZD) المنشورة سابقًا. تعمل هذه الطريقة بلطف على ضغط عضو جنيني أو عضو بين غطاء زجاجي وغشاء في كمية كبيرة من الوسط وتوفر ظروفًا ممتازة للتصوير لمدة تصل إلى 12 يومًا. معا، تسمح هذه الطرق الأوعية الدموية وتدفق الدم إلى الاعضاء الكلوية وثقافات الكلى organotypic مع تحسين التصوير البؤري. الطرق الموصوفة هنا مفيدة للغاية لدراسة الوظائف الأساسية والتطبيقية للكلى على سبيل الكفو. وتنطبق كلتا الطريقتين على أنواع مختلفة من الأنسجة والأنسجة.
Introduction
أصبحت الثقافة الأورجة للكلى الجنينية نموذجا هاما لدراسة الكلية منذ عقود1،2،3. تمثل الرينالودات نظامًا نموذجيًا متقدمًا لدراسة تطور الكلى الصحية والمريضة4. العيب الرئيسي لكلا الطريقتين، ومع ذلك، هو أن أيا من الأسلوبين خلاصة الوظيفة الرئيسية للكلية: ترشيح الدم. الكلى والأوعية الدموية تتطور في الحلقات الكلوية وثقافات الأورجان وبمماثلة إلى مرحلة مبكرة في التنمية الفيفو; ومع ذلك ، فإن الكبيبات التي تشكلت في المختبر لا تزال وعائية5. الأوعية الدموية من الكلى الجنينية على سبيل لا ينف والأعضاء الكلوية وقد أظهرت سابقا في تجارب زرع فقط تحت في ظروف الجسم الحي. على سبيل المثال، زرع الأعضاء الكلوية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت كبسولة كلية فأرة يسمح بتطوير الكلى في الجهازية إلى مرحلة وظيفية6.
النهج الوسيط بين الثقافات المختبرية البحتة وفي طرق زرع الجسم الحي هو زرع xenotransplant إلى CAM من أجنة الطيور. وقد ثبت الأوعية الدموية من primordia الكلى الماوس سليمة سابقا باستخدام هذا النظام7,8. ومع ذلك ، فقد تبين أيضا أن الأوعية الدموية الكلوية في الكلى المورين المزروعة xenotransplanted مشتق من الإندوثيوليوم المضيف ، وليس الكسب غير المشروع9. وقد قللت هذه الملاحظة بشكل كبير من إمكانات النماذج الكيميرية (الثدييات الطيورية) للكلى الجنينية لدراسة تطور الأوعية الدموية الكلوية، لأن الظروف التجريبية كانت غير متساهلة لبقاء الخلايا البطانية المشتقة من المانحين.
عرض في الجزء الأول من هذا البروتوكول هو طريقة محسنة لزراعة الكلى الجنينية الماوس على CAM من بيض الطيور، والجمع بين الظروف البيئية الدقيقة من الثقافة organotypic وxenotransplant. التحسن الرئيسي في الأساليب السابقة هو أنه بدلا من وضع الكلى الجنينية الماوس والأعضاء الكلوية مباشرة على CAM، يتم تراكب منطقة زرع مع الخزانات الصغيرة نفاذية مليئة المتوسطة الثقافة التي تزود الأنسجة المزروعة مع المواد الغذائية وحمايتها من التجفيف. ويزداد معدل نجاح التجارب زيادة كبيرة وتتحسن ظروف تطوير الأوعية الدموية المستمدة من المانحين. تطبيق هذه الطريقة على الثقافات xenotransplant يؤدي إلى تطوير الأوعية الدموية الكبيبية تتألف من الخلايا الذاتية الذاتية من الكلى المانحة.
التحليل التفصيلي للمورفوجينيسيس الخلوي هو تطبيق مهم آخر لنماذج زراعة الكلى. أساليب ذكرت سابقا من الحصول على صورة الفاصل الزمني من الكلى الثقافات كافية فقط لتحليل مورفولوجيا العام ونقش الكلى الجنينية، ولكن ليس لتتبع الخلايا الفردية10. في الآونة الأخيرة، وصفت رواية ثابتة Z-الاتجاه (FiZD) طريقة تهدف إلى عالية الدقة confocal 3D الوقت الفاصل تصوير organoids الكلوية والثقافات organotypic11. في هذه الطريقة ، يتم ضغط الأعضاء والأعضاء الجنينية بلطف بين غطاء زجاجي وغشاء نفاذي لإدراج ترانسويل في لوحة مصممة خصيصًا حتى يصل سمك العينة إلى 70 ميكرومتر ، مما يوفر الظروف البصرية المثلى للتصوير. في الجزء الثاني من الأساليب ، يتم وصف بروتوكول مفصل لتصنيع لوحة مصممة خصيصًا وإعداد تجارب FiZD للتصوير المنجري على المدى الطويل.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم تقديم بروتوكولين مفصلين يصقلان طريقة الثقافة الكلوية الكلاسيكية، ويمكّنان من الأوعية الدموية، والتنمية الموسعة، والتصوير الأمثل 4D (أي الصورة والوقت ثلاثي الأبعاد) للكلى الجنينية الجنينية العضوية. يسلط هذا القسم الضوء على الخطوات الهامة في الأساليب ويناقش استكشاف الأخطاء وإصلاحها.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل ماليا ً أكاديمية سومن أكاتيميا (أكاديمية فنلندا) (206038، 121647، 250900، 260056؛ منحة مركز التميز 2012-2017 251314)، Munuaissäätiö – جمعية الكلى والكبد الفنلندية، سيغريد جوليوكسن ساتيو، فيكتورياستفيلسن، المؤسسة الثقافية السويدية في فنلندا، نوفو نورديسك، Syöpäjärjestöt (جمعية السرطان في فنلندا)، وبرنامج الإطار السابع للجماعة الأوروبية (FP7/2007-2013؛ منحة FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608)، وH2020 ماري Sklodowska-Curie إجراءات شبكة التدريب المبتكر “RENALTRACT” مشروع ID 642937. ويشكر المؤلفون بولا هيبوس ويوهانا كيكولاهتي – ليياس وهانيل هرمان على المساعدة التقنية.
تتم إعادة طباعة الأرقام 3 و 4 و الفيلم 2 بإذن من التطوير.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. 发育生物学. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
