Optimización del cultivo organoide renal y organatípico para la vascularización, el desarrollo extendido y la imagen mejorada de microscopía

El cultivo organotípico de los riñones embrionarios se convirtió en un modelo importante para estudiar la nefrogénesis hace décadas^1,2,3. Los organoides renales representan un sistema modelo avanzado para el desarrollo de riñones sanos y enfermos^4. El principal inconveniente para ambos métodos, sin embargo, es que ninguno de los dos métodos recapitula la función principal del riñón: la filtración de sangre. Las nefronas y la vasculatura renal se desarrollan en organoides renales y cultivos organotípicos de forma similar al desarrollo in vivo en etapa temprana; sin embargo, los glomérulos formados in vitro permanecen avasculares^5. La vascularización de los riñones embrionarios ex vivo y los organoides renales se demostró previamente en experimentos de trasplante solo en condiciones in vivo. Por ejemplo, el trasplante de organoides renales pluripotentes derivados de células madre humanas bajo una cápsula renal de ratón permite el desarrollo de las nefronas en el organoide a una etapa funcional^6.

Un enfoque intermedio entre cultivos puramente in vitro y métodos de trasplante in vivo es el xenotrasplante a la CAM de embriones aviares. La vascularización de la primordia renal intacta se ha demostrado previamente utilizando este sistema^7,8. Sin embargo, también se demostró que la vasculatura renal en el riñón murino xenotransplanted se deriva del endotelio huésped, no del injerto^9. Esta observación redujo significativamente el potencial de los modelos quiméricos (aviares-mamíferos) de riñón embrionario para estudiar el desarrollo de la vasculatura renal, porque las condiciones experimentales no eran permisivas para la supervivencia de las células endoteliales derivadas de donantes.

En la primera parte de este protocolo se presenta un método mejorado para el cultivo de riñones embrionarios de ratón en CAM de huevos aviares, combinando condiciones microambientales de cultivo organotípico y xenotrasplante. La principal mejora de los métodos anteriores es que en lugar de colocar los riñones embrionarios de ratón y los organoides renales directamente en el CAM, el área de implantación se superpone con minidepósitos permeables llenos de medio de cultivo que suministran el tejido trasplantado con nutrientes y protegerlo del secado. La tasa de éxito de los experimentos aumenta significativamente y las condiciones para el desarrollo de la vasculatura derivada de donantes mejoran. La aplicación de este método a los cultivos xenotrasplantes da como resultado el desarrollo de vasculatura glomerular compuesta por células endoteliales endógenas de los riñones de los donantes.

El análisis detallado de la morfogénesis celular es otra aplicación importante de los modelos de cultivo renal. Los métodos notificados anteriormente de adquisición de imágenes de lapso de tiempo de cultivos renales son suficientes sólo para el análisis de la morfología general y el patrón del riñón embrionario, pero no para el seguimiento de células individuales^10. Recientemente, se describió¹¹un nuevo método de Dirección Z Fija (FiZD) destinado a la toma de imágenes de lapso de tiempo 3D confocales de alta resolución de organoides renales y cultivos organotípicos organotípicos. En este método, los organoides y los órganos embrionarios se comprimen suavemente entre un tapón de vidrio y una membrana permeable de un inserto transpoente en una placa diseñada a medida hasta que el espesor de la muestra alcanza los 70 m, proporcionando condiciones ópticas óptimas para la toma de imágenes. En la segunda parte de los métodos, se describe un protocolo detallado para la fabricación de una placa diseñada a medida y la configuración de experimentos FiZD para imágenes organoides a largo plazo.