Optimering af renal organoid og organotypic kultur for vaskularisering, udvidet udvikling, og forbedret mikroskopi Imaging
Summary
Dette arbejde beskriver to metoder til at studere organudvikling, en forbedret xenotransplantation setup på chorioallantoic membran (CAM) fra aviær embryoner, der giver mulighed for vaskularisering af dyrkede embryonale organer og organoider og en ny fast z-retning organkulturmetode med modificerede eksperimentelle betingelser, der giver mulighed for konfokal billeddannelse med høj opløsning.
Abstract
Embryonale nyre organotypic kulturer, og især pluripotente stamceller-afledte nyre organoider, er fremragende værktøjer til at følge udviklingsprocesser og modellering nyresygdom. Men modellerne er begrænset af en mangel på vaskularisering og funktionalitet. For at løse dette, en forbedret protokol for metoden til xenografting celler og væv til chorioallantoic membran (CAM) af en aviær embryo for at få vaskularisering og restaurering af blodgennemstrømningen blev udviklet. Transplantatet er overlejret med specialfremstillede minireservoirer, der fastgør prøverne til CAM og forsyner dem med dyrkningsmedium, der beskytter grafts mod tørring. Den forbedrede kulturmetode gør det muligt for xenografts at vokse i op til 9 dage. Håndskriftet beskriver også, hvordan man kan give optimale betingelser for langsigtet konfokal billeddannelse af renale organoider og organotypic kulturer ved hjælp af den tidligere offentliggjorte Fixed Z-Direction (FiZD) metode. Denne metode komprimerer forsigtigt et embryonalt organ eller organoid mellem en glasdæksel og membran i en stor mængde medium og giver fremragende betingelser for billeddannelse i op til 12 dage. Sammen, disse metoder tillader vaskularisering og blodgennemstrømning til nyre organoider og organotypic nyrekulturer med forbedret konfokal billeddannelse. De metoder, der er beskrevet her, er meget gavnligt for at studere grundlæggende og anvendte funktioner nyrer ex vivo. Begge metoder gælder for forskellige typer af væv og organoider.
Introduction
Organotypic kultur embryonale nyrer blev en vigtig model til at studere nephrogenesis årtier siden1,2,3. Renal organoider repræsenterer et avanceret modelsystem til undersøgelse af udviklingen af sunde og syge nyrer4. Den største ulempe for begge metoder, dog, er, at ingen af metoderne opsummerer den vigtigste funktion af nyrerne: blodfiltrering. Nephroner og renal vaskulatur udvikle sig i renal organoider og organotypic kulturer på samme måde som tidlige stadium i vivo udvikling; men glomeruli dannet in vitro forbliver avaskulær5. Vaskularisering af ex vivo embryonale nyrer og renale organoider blev tidligere kun påvist i transplantationsforsøg under in vivo-forhold. For eksempel, transplantation af humane pluripotente stamceller-afledte nyre organoider under en mus nyre kapsel giver mulighed for udvikling af nefroner i organoid til en funktionel fase6.
En mellemliggende tilgang mellem rent in vitro-kulturer og in vivo-transplantationsmetoder er xenotransplantation til CAM af aviær embryoner. Vaskularisering af intakt mus nyre primordia er blevet påvist tidligere ved hjælp af dette system7,8. Det blev dog også påvist, at renal vaskulaturen i xenotransplanterede murine nyre var afledt9af værten endotel, ikke transplantat9 . Denne observation reducerede i betydelig grad potentialet i kimære (aviær-pattedyr) modeller af embryonale nyrer til at studere udviklingen af renal vaskulaturen, fordi de eksperimentelle betingelser var nonpermissive for overlevelsen af donor-afledte endotelceller.
Præsenteret i første del af denne protokol er en forbedret metode til dyrkning af mus embryonale nyrer på CAM af aviær æg, der kombinerer mikromiljømæssige betingelser for organotypic kultur og xenotransplantation. Den største forbedring af tidligere metoder er, at i stedet for at placere musen embryonale nyrer og renal organoids direkte på CAM, implantation området er overlejret med gennemtrængelige minireservoirer fyldt med kultur medium, der leverer det transplanterede væv næringsstoffer og beskytte det mod tørring. Succesraten for forsøgene øges betydeligt, og betingelserne for udvikling af donorafledt vaskulatur forbedres. Anvendelse af denne metode på xenotransplantkulturer resulterer i udvikling af glomerulær vaskulatur bestående af endogene endotelceller fra donornyrer.
Detaljeret analyse af cellulære morfogenese er en anden vigtig anvendelse af nyre kultur modeller. Tidligere rapporterede metoder til time-lapse billede erhvervelse af nyrekulturer er tilstrækkelige kun til analyse af den samlede morfologi og mønstre af embryonale nyre, men ikke til sporing af individuelle celler10. For nylig, en ny Fast Z-Direction (FiZD) metode med henblik på høj opløsning konfokale 3D time-lapse billeddannelse af nyre organoider og organotypic kulturer blev beskrevet11. Ved denne metode komprimeres organoiderne og embryonale organer forsigtigt mellem en glasdæksel og en gennemtrængelig membran af et transwell-skær i en specialdesignet plade, indtil prøvens tykkelse når 70 μm, hvilket giver optimale optiske betingelser for billeddannelse. I den anden del af metoderne beskrives en detaljeret protokol til fremstilling af en specialdesignet plade og opsætning af FiZD-eksperimenter til langsigtet organoid billeddannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
To detaljerede protokoller præsenteres, der forfine den klassiske renal organotypic kultur metode, og muliggøre vaskularisering, udvidet udvikling, og optimal 4D (dvs. 3D-billede og tid) billeddannelse af ex vivo embryonale nyrer og organoider. I dette afsnit fremhæves de kritiske trin i metoderne, og fejlfinding beskrives.
Den betydelige forskel mellem andre CAM kultur metoder og denne forbedrede kylling CAM kultur metode er brugen af skræddersyede minireservoirer i xenografting af embryo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet økonomisk af Suomen Akatemia (Finlands Akademi) (206038, 121647, 250900, 260056; Ekspertisecentertilskud 2012-2017 251314), Munuaissäätiö – Finsk Nyre- og Leverforening, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Den Svenske Kulturfond i Finland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlands Kræftselskab), Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013; tilskud FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) og H2020 Marie Sklodowska-Curie Actions Innovative Training Network “RENALTRACT” Projekt ID 642937. Forfatterne takker Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias og Hannele Härkman for teknisk bistand.
Figur 3, 4 og Movie 2 genoptrykkes med tilladelse fra Udvikling.
Materials
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22×22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. . Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. 发育生物学. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
