Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

En 2000, Gan y otros describieron una técnica de etiquetado rápido para neuronas individuales y glia en el sistema nervioso que combinaba varios colorantes lipofílicos, permitiendo el etiquetado simultáneo de muchas células cerebrales con diferentes colores^1,,2. Más recientemente, una técnica de etiquetado balístico fue descrita por Seabold et al.³ que introdujo colorantes fluorescentes (Dil) en las neuronas de las rebanadas cerebrales. Una técnica de tinción versátil, el etiquetado balístico es apreciado por su capacidad para ser utilizado en múltiples especies animales y a través de una amplia gama de edades. Además, se puede combinar con inmunostaining para identificar subpoblaciones de células cerebrales³. En comparación con las técnicas tradicionales (por ejemplo, imperraje de plata Golgi-Cox, microinyección)⁴, el etiquetado balístico ofrece la oportunidad de distinguir más claramente las características morfológicas, incluidas las espinas dendríticas, una característica que es fundamental para extraer inferencias sobre la complejidad neuronal y la conectividad sináptica^5.

Las neuronas piramidales excitatorias se caracterizan por una sola dendrita apical grande, múltiples dendritas basales más cortas y miles de espinas dendríticas^6. Las neuronas piramidales se encuentran en múltiples regiones cerebrales relacionadas con el procesamiento cognitivo de orden superior, incluyendo la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo. En el PFC, las neuronas piramidales se observan en las capas II/III y V, con cada una de ellas una morfología única. Específicamente, las neuronas piramidales en la capa II/III de la PFC tienen una dendrita apical más corta y menos ramificación que las neuronas piramidales en la capa V^6. Dentro del hipocampo, las neuronas piramidales se encuentran en las regiones CA1 y CA3, con cada una mostrando morfologías distintas. Específicamente, las neuronas piramidales en la región CA1 exhiben una dendrita apical más distintiva, con ramificaciones que ocurren más lejos del soma, en relación con la región^{CA3 6.}

Las espinas dendríticas en las neuronas piramidales tanto en el PFC como en el hipocampo son el sitio principal de las sinapsis excitatorias^7. Las características morfológicas de las espinas dendríticas, que se caracterizan clásicamente en tres categorías primarias (es decir, delgadas, rechonchas o setas^8),se han relacionado con el tamaño de la sinapsis excitatoria⁹. Las espinas delgadas, caracterizadas por un cuello largo y delgado, una cabeza bulbosa pequeña y densidades postsinápticas más pequeñas, son más inestables y desarrollan conexiones más débiles. Sin embargo, las espinas de setas, que tienen una cabeza de la columna vertebral dendrítica más grande, son reconocidas por formar conexiones sinápticas más fuertes, un efecto resultante de su mayor tamaño. En contraste agudo, las espinas rechonchas están desprovistas de un cuello de columna vertebral, exhibiendo una relación de volumen de cabeza y cuello aproximadamente igual^8. Dentro del hipocampo, también se pueden observar espinas ramificadas, por lo que la columna vertebral tiene múltiples cabezas que emergen del mismo cuello dela dorsal dendrítico^10. Por lo tanto, los cambios morfológicos de las espinas dendríticas podrían reflejar la funcionalidad y la capacidad estructural. Además, los estudios han demostrado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas se relaciona con su plasticidad estructural, lo que lleva a la idea de que las espinas pequeñas están involucradas en el aprendizaje y la atención, mientras que las espinas más grandes y estables, están involucradas en procesos a largo plazo, incluida la memoria^11. Además, la distribución de espinas dendríticas a lo largo de la dendrita puede estar asociada con la conectividad sináptica^5,12.

Por lo tanto, el presente documento metodológico tiene tres objetivos: 1) Presentar nuestro protocolo de etiquetado balístico, que ha sido utilizado con una tasa de éxito (es decir, neuronas que cumplen con los criterios de selección y apropiado para el análisis) de 83,3%^5,12,13 y en múltiples regiones cerebrales (es decir, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demostrar la generalización de la técnica y su aplicación a las neuronas cultivadas in vitro; 3) Detallar la metodología utilizada en el software de reconstrucción neuronal y las inferencias que se pueden extraer de dichos datos.