Ecocardia ad ultrasuoni ad alta frequenza per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra
Summary
Descriviamo un protocollo per valutare la morfologia cardiaca e la funzione nel pesce zebra adulto utilizzando l’ecocardiografia ad alta frequenza. Il metodo consente la visualizzazione del cuore e la successiva quantificazione dei parametri funzionali, come la frequenza cardiaca (HR), l’uscita cardiaca (CO), il cambiamento dell’area frazionaria (FAC), la frazione di espulsione (EF) e la velocità di afflusso e deflusso del sangue.
Abstract
Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un organismo modello molto popolare nella ricerca cardiovascolare, comprese le malattie cardiache umane, in gran parte a causa della sua trasparenza embrionale, della trattatibilità genetica e dell’amenità a studi rapidi e ad alto potenziale di sviluppo. Tuttavia, la perdita di trasparenza limita l’analisi della funzione cardiaca nella fase adulta, il che complica la modellazione delle condizioni cardiache legate all’età. Per superare tali limitazioni, l’ecocardiografia ad ultrasuoni ad alta frequenza nel pesce zebra sta emergendo come opzione praticabile. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra adulto mediante ecocardiografia non invasiva utilizzando ultrasuoni ad alta frequenza. Il metodo consente la visualizzazione e l’analisi della dimensione cardiaca del pesce zebra e la quantificazione di importanti parametri funzionali, tra cui la frequenza cardiaca, il volume dell’ictus, l’uscita cardiaca e la frazione di espulsione. In questo metodo, i pesci sono anestesizzati e tenuti sott’acqua e possono essere recuperati dopo la procedura. Sebbene gli ultrasuoni ad alta frequenza siano una tecnologia costosa, la stessa piattaforma di imaging può essere utilizzata per diverse specie (ad esempio, murine e pesci zebra) adattando diversi trasduttori. L’ecocardiografia del pesce zebra è un metodo robusto per la fenotipizzazione cardiaca, utile nella convalida e caratterizzazione dei modelli di malattia, in particolare le malattie ad esordio tardivo; schermi di droga; e studi di lesioni cardiache, recupero e capacità rigenerativa.
Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è un modello di vertebrato ben consolidato per gli studi sui processi di sviluppo e sulle malattie umane1. I pesci zebra hanno un’elevata somiglianza genetica con l’uomo (70%), la trattatibilità genetica, l’elevata fecondità e la trasparenza ottica durante lo sviluppo embrionale, che consente l’analisi visiva diretta di organi e tessuti, compreso il cuore. Pur avendo un solo atrio e un ventricolo, il cuore di pesce zebra (Figura 1) è fisiologicamente simile ai cuori a quattro camere di mammiferi. È importante sottolineare che la frequenza cardiaca del pesce zebra, la morfologia dell’elettrocardiogramma e la forma potenziale di azione assomigliano a quelle degli esseri umani più delle specie murine2. Queste caratteristiche hanno reso il pesce zebra un ottimo modello per la ricerca cardiovascolare e hanno fornito importanti approfondimenti sullo sviluppo cardiaco3,4, rigenerazione5, e le condizioni patologiche1,3,4, tra cui arteriosclerosi, cardiomiopatie, aritmie, malattie cardiache congenite, e amiloide luce catena cardiotossicità1,4,6. La valutazione della funzione cardiaca è stata possibile durante lo stadio embrionale (1 giorno dopo la fecondazione) attraverso l’analisi video diretta utilizzando la microscopia video ad alta velocità7,8. Tuttavia, i pesci zebra perdono la loro trasparenza oltre lo stadio embrionale, limitando le valutazioni funzionali dei normali cuori maturi e delle condizioni cardiache a esordio tardivo. Per superare questa limitazione, l’ecocardiografia è stata impiegata con successo come un’alternativa ad alta risoluzione, in tempo reale e non invasiva per valutare la funzione cardiaca del pesce zebra adulto9,10,11,12,13,14,15.
Nel pesce zebra, il cuore si trova ventralmente nella cavità toracica immediatamente posteriore alle branchie con l’atrio situato dorsale al ventricolo. L’atrio raccoglie sangue venoso dal venoso sinusae e lo trasferisce al ventricolo dove viene ulteriormente pompato al bulbus arteriosus (Figura 1). Qui, descriviamo un protocollo fisiologico, sott’acqua, per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra adulto mediante ecocardiografia non invasiva utilizzando una sonda a ultrasuoni a matrice lineare con una frequenza centrale di 50 MHz per l’imaging in modalità B con una risoluzione di 30 m. Poiché le onde a ultrasuoni possono facilmente viaggiare attraverso l’acqua, mantenendo la vicinanza tra il pesce e la sonda di scansione sott’acqua fornisce una superficie di contatto sufficiente per il rilevamento del cuore senza bisogno di gel ad ultrasuoni ed è nel complesso meno stressante per il pesce. Anche se i sistemi di ecocardiografia alternativa del pesce zebra sono stati segnalati da diversi autori9,12,13, qui presentiamo l’impostazione generale e più comunemente usata che si applica agli ultrasuoni ad alta frequenza negli animali.
Il metodo consente l’imaging ad alta risoluzione del cuore adulto di pesce zebra, tracciando le strutture cardiache e la quantificazione delle velocità di picco dalle misurazioni del flusso sanguigno di Doppler. Mostriamo una quantificazione affidabile in vivo di importanti parametri sistolici e diastolici, come la frazione di espulsione (EF), il cambiamento dell’area frazionaria (FAC), l’afflusso di sangue ventricolare e le velocità di deflusso, la frequenza cardiaca (HR) e l’uscita cardiaca (CO). Contribuiamo a stabilire una gamma affidabile di normali parametri funzionali e dimensionali cardiaci di pesce zebra adulto sani per consentire una valutazione più precisa degli stati patologici. Nel complesso, forniamo un metodo robusto per valutare la funzione cardiaca nel pesce zebra, che si è dimostrato estremamente utile per stabilire e convalidare i modelli di malattie cardiache del pesce zebra6,16, lesioni cardiache e recupero10,13, e rigenerazione11,12, e può essere ulteriormente utilizzato per valutare potenziali farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un metodo sistematico per l’imaging ecocardiografico e la valutazione della funzione cardiaca nel pesce zebra adulto. L’ecocardiografia è l’unico metodo disponibile non invasivo e più robusto per l’imaging cardiaco dei pesci adulti vivi e l’analisi funzionale, e sta diventando sempre più popolare nella ricerca cardiovascolare dei pesci zebra. La quantità di tempo necessaria è breve e consente studi ad alto valore di velocità effettiva e longitudinali. Tuttavia, vi è una notevole variazione nella metodo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il supporto tecnico di Fred Roberts e la revisione del manoscritto.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
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