Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

La división celular se estudia a menudo utilizando líneas celulares cultivadas en el cultivo¹. Si bien hemos obtenido una gran cantidad de información y comprensión inestimables de los mecanismos fundamentales de estos estudios², las células cultivadas en el cultivo no pueden recapitular completamente la fisiología de la división celular como ocurre en el tejido vivo intacto. Por ejemplo, en los tejidos y órganos intactos, las células deben dividirse en el lugar correcto y en el momento adecuado para que las células de la progenie estén adecuadamente situadas dentro del tejido, de modo que puedan someterse a una adecuada diferenciación o programas funcionales, y para que la proliferación celular esté adecuadamente coordinada con el crecimiento tisular o la homeostasis^3. En el caso de las células cultivadas en cultivo, por otro lado, la división celular está generalmente regulada por factores de crecimiento en el medio de cultivo^4,y por lo tanto no podemos aprender de estas células cómo factores ambientales in vivo como la arquitectura de tejidos o la señalización del desarrollo influyen en el proceso de división. También es importante tener en cuenta que muchas de las líneas celulares utilizadas para estudiar la división celular, como las células HeLa y U2OS, se derivaron de tumores metastásicos^5. Por lo tanto, muchos aspectos de la fisiología básica de estas células cancerosas, como los mecanismos reguladores del ciclo celular y la estabilidad cromosómica, probablemente han sido alterados en comparación con las células sanas. La comprensión completa de la fisiología de la división celular, por lo tanto, depende de nuestra capacidad para estudiar células divisorias en sus entornos nativos in vivo que preservan los mecanismos reguladores fisiológicos y la arquitectura de los tejidos.

Los avances en la comprensión de cómo funciona la división celular dentro de los tejidos y órganos intactos se ven obstaculizados por dificultades inherentes al análisis in vivo o ex vivo. En primer lugar, puede ser difícil o imposible acceder a las células divisorias para el análisis microscópico dentro de órganos grandes o tejidos gruesos. En segundo lugar, a menudo es difícil predecir cuándo las células individuales se dividirán in vivo. En tercer lugar, la fisiología tisular puede deteriorarse rápidamente durante el cultivo ex vivo. En este protocolo, describimos métodos fácilmente accesibles para el análisis en vivo y fijo de los espermatocitos Drosophila melanogaster a medida que se someten a divisiones celulares meióticas dentro de testículos totalmente intactos. Estas células son ideales para el análisis vivo y ex vivo porque son fácilmente accesibles con métodos ópticos estándar como la microscopía confocal, se dividen en momentos y ubicaciones predecibles, y los testículos intactos se pueden mantener en cultivo ex vivo durante aproximadamente 24 horas. Además, los espermatocitos Drosophila son células redondas grandes (aproximadamente de 20 a 30 m de diámetro) que no cambian de forma cuando se dividen, por lo que son ideales para imágenes de alta resolución y lapso de tiempo de componentes celulares como el aparato del husillo y los orgánulos citoplasma. Aunque estas células sufren meiosis en comparación con la mitosis, muchos de los procesos esenciales de división celular son muy similares entre estos dos mecanismos de división celular⁶. Estas ventajas, combinadas con potentes herramientas genéticas Drosophila, han hecho de los espermatocitos Drosophila un modelo ampliamente utilizado para el análisis ex vivo de procesos esenciales de división celular incluyendo la formación y regulación de husillos, la citokinesis, y la remodelación y partición de orgánulos^{7,,8,9,,10,11}.

Los espermacitos son células que se encuentran en la etapa meiótica de la espermatogénesis. En Drosophila,la espermatogénesis comienza con un grupo de células madre germinales que se encuentran en una pequeña región o “hub” en un polo del testículo^12,,13. Estas células se dividen por una mitosis asimétrica, dando lugar a un solo espermatogonio diferenciado. Luego, la espermatogonia se somete a cuatro mitosis síncronas para producir un grupo de 16 células que permanecen estrechamente asociadas dentro de un solo quiste. En esta etapa, las células pasan de un ciclo celular mitético a un ciclo celular meiótico y se conocen como espermatocitos. Los espermacitos pasan alrededor de dos a tres días en una etapa G2 extendida del ciclo celular, durante la cual crecen dramáticamente y experimentan cambios citológicos en la preparación para las dos divisiones meióticas y posterior espermiogénesis^13,,14. Todo el grupo de 16 espermatocitos dentro de un solo quiste entonces entra en la primera división meiótica al mismo tiempo. Por lo tanto, varios esperamorcitos meióticos se pueden crear imágenes simultáneamente a medida que avanzan a través de la división celular. La primera división meiótica continúa durante aproximadamente 1,5 h y es seguida casi inmediatamente por la segunda división meiótica, produciendo 64 espermatozoides totales que pasan a diferenciarse en espermatozoides maduros.

Una ventaja única de usar espermacitos para estudiar la división celular en vivo, tejido intacto es que los grupos o quistes de las células progresan constantemente a través de las diferentes etapas de la espermatogénesis, y las células en todas las etapas de la espermatogénesis generalmente se pueden identificar en cualquier testículo dado (ver Figura 3A). Por lo tanto, es relativamente fácil encontrar células meióticas en testículos enteros. Por lo general, centramos nuestros análisis en la primera en lugar de la segunda meiosis porque estas células son mucho más grandes y más susceptibles a las imágenes de alta resolución, pero todo el proceso que abarca ambas divisiones meióticas se puede tomar imágenes con éxito. También debe tenerse en cuenta que el protocolo general para la preparación y el cultivo de testículos se puede utilizar para analizar otros procesos de espermatogénesis, así, como la célula madre mitotica anterior o divisiones espermatogoniales o los cambios citológicos que se producen a medida que los espermatozoides maduran en espermatozoides^15. Muchos de estos aspectos de la espermatogénesis están muy conservados entre Drosophila y los seres humanos^16.

Los espermatocitos drosófilos comienzan a alcanzar la fase meiótica de la espermatogénesis durante la tercera etapa larval instar del desarrollo de Drosophila ¹³. Por lo tanto, los testículos aislados de las etapas del ciclo de vida a partir de larvas de tercera estrella e incluyendo pupas y adultos se pueden utilizar para el análisis de la división de espermacitos. Varios protocolos excelentes están disponibles para la extracción de testículos de moscas macho adultas para análisis vivos y fijos de espermatogénesis^17,18,19. Estos protocolos pueden ser preferibles para estudiar etapas tardías de la espermatogénesis o si se deben utilizar marcadores genéticos que solo son visibles en adultos. El protocolo se centra en cambio en la preparación de testículos a partir de larvas y pupae tempranas, porque los testículos en estas etapas tienen varias ventajas que son específicamente pertinentes para el análisis de la división celular por microscopía de lapso de tiempo de alta resolución. En primer lugar, los testículos de larvas y pusias son más pequeños que los de adultos, y las células dentro del órgano están menos llenas. Debido a esto, los espermismocitos divisorios a menudo se pueden tomar imágenes cerca de la superficie externa de los testículos larvales, sin tener que penetrar a través de múltiples capas de tejido de dispersión de luz. En segundo lugar, los testículos adultos se mueven rítmicamente debido a las contracciones de los órganos accesorios conectados, y estos movimientos hacen que la toma de imágenes de lapso de tiempo de células individuales sea un desafío. Y en tercer lugar, los testículos larvales son ventajosos cuando se estudian mutaciones genéticas que causan letalidad pupal o adulta. Nuestros métodos están optimizados para el cultivo a largo plazo de testículos en la etapa del microscopio, lo que permite la toma de imágenes de múltiples rondas de división celular o la progresión de células individuales a través de múltiples etapas de espermatogénesis en la misma preparación. También describimos un protocolo para la fijación y la inmunomanchación de testículos enteros. En general, nuestros protocolos son particularmente útiles para aquellos interesados en estudiar la división celular en tejido intacto, y la capacidad de combinar el análisis de espermatocitos con herramientas genéticas Drosophila altamente manejables hace de este un enfoque especialmente poderoso.