通过定量染色体形成捕获（4C）鉴定胚胎体增强剂-促进者接触

1. 小鼠胚胎干细胞胚胎体生成 制备mESC无血清培养培养基：DMEM/F12和神经基础介质以1：1的比例混合。培养基辅以MEM非必需氨基酸溶液（1倍）、丙酮钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（100 U/mL）、β-梅尔卡托 乙醇（50 μM）、N2和B27补充剂（1倍）、PD0325901（1 μM）、CHIR99021（3 μM）和白血病抑制因子（LIF）（1，000 U/mL）。 制备EB分化介质：DMEM补充10%胎儿牛血清（FBS）、MEM非必需氨基酸（1倍）、丙酮钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（100 U/mL）、β-甲醇（50μM）。 在 10 厘米塑料菜肴上培养 mESC，在 mESC 培养无血清介质中预涂 0.1% （w/v） 明胶。 当 mESC 达到 60% 的汇合度时，去除培养介质，用 2 mL 消毒 PBS 轻轻洗涤 1x。 完全取出PBS，并加入2 mL的细胞分离介质。在37°C孵育培养皿5分钟。 通过在盘中加入8 mL的EB分化介质来灭活反应。 通过上下移液15-20次分离mESC菌落，以获得单细胞悬浮液。 在室温 （RT） 下以 300 x g 的 300 x g离心 5 分钟，并小心地取出上清液。 计算细胞（例如，使用血细胞计）。 用EB分化介质重新悬浮细胞颗粒，并将浓度调整到2 x 104细胞/mL。 反转 15 厘米培养盘的盖子，并使用 200 μL 多通道移液器在盖子上沉积 20 μL 的重新悬浮细胞（+400 细胞/滴）。 小心地将盖子倒置到底部腔室上，在37°C下用悬挂液滴孵育，5%CO2和95%湿度为3天。 用 10 mL PBS 轻轻清洗盖子，将含 EB 的悬浮液转移到 50 mL 塑料管中，收集 EB。 将管置于 RT 上 30 分钟，以便 EB 通过重力沉入底部。小心地取出上清液。 用10 mL的新鲜EB分化介质轻轻重新悬浮EB，并转移到10厘米细菌培养皿中。 3-6 天后使用倒置显微镜检查 EB 形成。生成的 EB 应是圆形和均匀的尺寸。 在37°C下孵育培养物，同时进行5%的CO2和95%的湿度。EB将继续分化成三个胚芽层，并可在不同的时间点收集进行分析。 2. EB 的分离 将 2 到 3 个 10 厘米的 PB 收集到 50 mL 塑料管中。在 RT 时将 EB 在 300 x g下离心 5 分钟，然后小心地取出上清液。 使用 10 mL PBS 重新挂起 EB。在 RT 时以 300 x g的离心 EB 3 分钟，并去除上清液。 添加 2 mL 胰蛋白酶-EDTA （0.25%）到颗粒，在37°C孵育管15分钟。 移液器上下每3分钟获得单细胞悬浮液。 加入8 mL的EB分化介质，停止胰蛋白酶反应。在显微镜下检查EB分离并计数细胞。 3. 固定 以 1 x 106细胞/mL 的速度重新悬浮新鲜 EB 培养基中的细胞。对于 50 mL 管，在 45 mL 介质中最多使用 4.5 x 107个单元。 将甲醛从37%的库存（不超过6个月）添加到1%的最终浓度。注意：在处理甲醛时，遵循适当的健康和安全规定，因为它是一种危险化学品。 在旋转下 RT 孵育 10 分钟。 通过将甘氨酸加入到0.125 M的最终浓度中来淬火甲醛。 在旋转下的 RT 孵育 5 分钟。 从现在起，将固定细胞转移到冰上，并在4°C下保持寒冷。 在冷藏离心机中以 300 x g的速度将细胞切碎 5 分钟。 丢弃上清液，在冷PBS中重新悬浮颗粒（1 mL，用于 5 x 106个细胞），然后转移到 1.5 mL 安全锁管中。 在4°C下以300 x g将细胞颗粒5分钟，丢弃上清液，并在液氮中捕捉冷冻颗粒。储存在-80°C或继续下面的协议。 4. 细胞裂酶和限制性酶消化 将细胞颗粒轻轻重新悬浮在新鲜制备的冰冷赖解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH = 8.0、10 mM NaCl、0.2% Igepal CA630 和 1x 蛋白酶抑制剂）中，每 2-5 x 106个细胞。要准备 5 mL 的 lysis 缓冲区，请参阅表 1。 在冰上孵育细胞15分钟。 在 1，000 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清液，并保留含有核的颗粒。 用500μL的冷水清缓冲液清洗颗粒核。 在 1x 缓冲 2 中以 50 μL 0.5% SDS 的 50 μL SDS 轻轻重新悬浮颗粒，然后在 62 °C 的加热块中孵育 10 分钟。 从加热块中取出管，加入170μL的消化缓冲液，含有25μL的10%三吨X-100，以淬火SDS。通过移液混合良好，避免过度发泡。 在37°C孵育15分钟。 加入25μL的消化缓冲液，通过反转混合，并采取8μL作为一个未消化的控制。将未消化的控制样品保持在 -20°C。将 100 U MboI 限制酶（25 U/μL 库存的 4 μL）添加到剩余核中，并在旋转 37°C 下消化染色质 2 小时。再添加另一个 100 U 的 MboI，再孵育 2 小时。 再加入100 U的MboI，并在37°C下一夜旋转孵育。 第二天，再加入100 U的MboI，在旋转37°C下孵育3小时。 以 8 μL 作为消化控制样品。通过添加80 μL的TE缓冲液（10 mM Tris pH = 8，1 mM EDTA）和10μL蛋白酶K（10mg/mL），从步骤4.8中分离消化消化控制样品和未消化的控制样品。在65°C孵育1小时。 在0.6%凝胶上运行20μL等位物，以检查消化效率。成功的消化主要显示3.0-0.5 kb范围内的碎片。 5. 接近连接和交联反转 在加热块中孵育65°C的MboI消化样品20分钟，使MboI失去活性，然后冷却至RT。 在 RT 时以 1，000 x g将管离心 5 分钟，去除上清液，并将颗粒溶解在 200 μL 的新鲜联体缓冲液中。 在每个样品中加入 1，000 μL 的结扎母混合物。要准备连接母体组合的 1，000 μL，请参阅表 2。 通过反转和孵育在RT一夜与缓慢旋转（9 rpm）。 加入100μL蛋白酶K（10mg/mL）和10μL的RNase A（10mg/mL），消除RNA和蛋白质残留物。在55°C孵育样品45-60分钟。 在 65 °C 下继续孵育样品，再孵育 4 小时。 6. DNA剪切和尺寸选择 冷却管到RT。 在 4 °C 下以 1，000 x g的离心机 5 分钟。 将样品分成2 mL管中的三个400μL等位，在每个管中加入2μL的糖原（20mg/m）、40μL的醋酸钠（3 M，pH = 5.2），以及2.5倍体积（1 mL）100%乙醇。在-80°C下进行反转和孵育45-60分钟混合。 在4°C下在16，000 x g下离心25分钟。旋转后将管子放在冰上，并通过移液小心地去除上清液。 通过在70%乙醇的800μL中重新悬浮来洗涤DNA颗粒。在 4 °C 下在 16，000 x g下离心 5 分钟。 去除上清液，用800μL的70%乙醇再次进行洗涤。 将颗粒溶解在 1x Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）的 130 μL 中，并在 37 °C 孵育 15 分钟以完全溶解 DNA。如有必要，使用移液重新悬浮任何沉淀物。 测量DNA产量;2.5-5 μg 染色质可望为 1 x 106细胞。通过在 0.6% 的琼脂胶凝胶上运行 3C 产品的 ± 200 ng 来检查结扎。成功的结扎主要显示DNA片段 > 3 kb。将样品存放在 -20 °C。 在 0.65 mL 管中稀释样品，该管适用于在 100 μL 的 1x Tris 缓冲体积（每管 1 μg）中声波到 10 纳克/μL。用于库制备的标准量为3μg，因此如有必要，在三个独立的管中执行声波。 使用声波器上的以下参数将DNA剪切到150-700 bp（平均=400-500 bp）的大小：循环：6-8，20 s-60 s关闭。这将使DNA适合使用光明场测序仪的高通量测序库制备。 将拉线DNA转移到一个正常的新的安全锁管。从同一样本池多个声波。 在RT加热一瓶DNA纯化珠。从现在开始，使用低绑定提示。 将 1.8 倍的珠子添加到 DNA 管中，轻轻重新悬浮。 在RT孵育5分钟。 用磁性架收集珠子。用 1 mL 新鲜制备的 80% 乙醇清洗珠子 2x，同时将管保持在磁性机架中。注：清除所有乙醇，包括残留液滴。 在 RT 时将珠子短暂（2-3 分钟）空气干燥。注：请勿干燥珠子超过 5 分钟。这将降低DNA产量。 用 90 μL 的 1x Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重新悬浮珠子，以释放 DNA。 测量DNA产量，并在1.5%凝胶上分析5μL等位。与预音速率相比，损失应该很小。 7. 图书馆为测序做准备 从库制备套件中加入 15 μL 的主混合。要修复胶合DNA的末端，将10μL的10倍端修复反应缓冲液和5μL的端修复酶混合物相结合。 在RT孵育30分钟。 加入1.1倍的DNA纯化珠，轻轻重新悬浮。 在RT孵育5分钟。 用磁性架收集珠子。用1 mL新鲜制备的80%乙醇清洗珠子两次，同时将管子保持在磁性架中。去除乙醇。 在RT时将珠子干2-3分钟。用42μL的1x三分缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重新悬浮珠子，以释放DNA。 在每个样品中加入8μL的dA尾接主混合物。要准备 dA 尾控主混合，请组合 5 μL 的 10x dA 尾矿反应缓冲液和 3 μL 的 Klenow 片段外减。 在37°C孵育30分钟。 加入2μL小牛肠道碱性磷酸酶（CIP）以脱磷脱脂DNA。 在37°C孵育30分钟，然后在50°C孵育60分钟。 加入1.1倍的DNA纯化珠，轻轻重新悬浮。 在RT孵育5分钟。 用磁性架收集珠子。用 1 mL 新鲜制备的 80% 乙醇清洗珠子 2x，同时将管保持在磁性机架中。 RT. 重新悬浮珠时短暂（2-3 分钟），具有 35 μL 的 1x Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8），以释放 DNA。 执行适配器连接反应。使用表 3中提到的降低适配器/ligase 浓度。 在20°C孵育15分钟。 加入3 μL的尿素DNA糖酶和DNA糖酶酶酶酶VII（例如，USER）酶的混合物，通过移液混合，并在37°C孵育15分钟。 用水将体积增加到100μL，在96°C下煮5分钟，然后将样品放在冰上。 加入1.1倍的DNA纯化珠，轻轻重新悬浮。 在RT孵育5分钟。 用磁性架收集珠子。用 1 mL 新鲜制备的 80% 乙醇清洗珠子 2x，同时将管保持在磁性机架中。 在RT时将珠子干2-3分钟。用50μL的1x三分缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重新悬浮珠子，以释放DNA。 8. 4C 染色质相互作用库扩增和纯化 使用 10 μL 库放大 4C 库以执行第一个 PCR。PCR 设置和程序可在表 4中找到。 执行嵌套 PCR。嵌套 PCR 设置和程序可在表 5中找到。 为每个库池 PCR 产品，并用 1.1 倍 DNA 纯化珠进行纯化。 测量DNA产量，并分析1.5%凝胶上的5μL等位。 调整库浓度并对库进行排序。如果编制索引，则可以在排序之前池化库。