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生物学

Feldidentifikation von Matricaria chamomilla mit einem tragbaren qPCR-System

Published: October 10, 2020
doi:
10.3791/60940
, , , , , , , , , , , , ,
1Herbalife NatSource (Hunan) Natural Products Co., Ltd., 2Corporate Quality Laboratory,Herbalife International of America, Inc., 3Corporate Quality,Herbalife International of America, Inc., 4Hyris Ltd, 5Natural Health Product Research Alliance,University of Guelph

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Feldidentifikation von Matricaria chamomilla mit einem tragbaren qPCR-System vorgestellt. Dieses einfach durchzuführende Protokoll eignet sich ideal als Methode zur Bestätigung der Identität einer botanischen Art an Orten, an denen der Zugang zu Laborgeräten und -kenntnissen eingeschränkt ist, wie z. B. landwirtschaftlichen Betrieben und Lagerhäusern.

Abstract

Die Qualitätskontrolle in botanischen Produkten beginnt mit der Rohstoffversorgung. Traditionell wird die botanische Identifizierung durch morphologische Bewertung und chemische Analysemethoden durchgeführt. Die mangelnde Verfügbarkeit von Botaniden, insbesondere in den letzten Jahren, in Verbindung mit der Notwendigkeit, die Qualitätskontrolle zu verbessern, um die Belastungen der Lieferkette zu bekämpfen, die durch die steigende Verbrauchernachfrage und den Klimawandel entstehen, erfordert jedoch alternative Ansätze. Ziel dieses Protokolls ist es, die Identifizierung botanischer Arten mit einem tragbaren qPCR-System auf dem Feld oder in jeder Umgebung zu erleichtern, in der der Zugang zu Laborgeräten und Fachwissen begrenzt ist. Die Ziel-DNA wird mit dye-based qPCR verstärkt, wobei DNA, die aus botanischen Referenzmaterialien extrahiert wird, als positiv elektrifiziert wird. Die Ziel-DNA wird durch ihre spezifische Verstärkung identifiziert und gleicht ihre Schmelzspitze mit der Positivkontrolle ab. Eine detaillierte Beschreibung der Schritte und Parameter, von der praktischen Feldprobenentnahme bis hin zur DNA-Extraktion, PCR-Verstärkung, gefolgt von der Dateninterpretation, wurde aufgenommen, um sicherzustellen, dass Leser dieses Protokoll replizieren können. Die ergebnisseergebnisse entsprechen den traditionellen botanischen Identifizierungsmethoden im Labor. Das Protokoll ist einfach durchzuführen und kostengünstig, so dass Qualitätstests an Rohstoffen so nah wie möglich am Ursprungsort der Lieferkette möglich sind.

Introduction

Die Praxis, Pflanzen zur Erhaltung und Verbesserung der Gesundheit zu verwenden, geht auf Tausende von Jahren zurück. Aufgrund der Belastungen der Lieferkette durch die gestiegene Verbrauchernachfrage1, nicht nachhaltige Erntepraktiken und den Klimawandel2, wird botanische Verfälschung zu einem wachsenden Problem in der Lebensmittel- und Nahrungsergänzungsmittelindustrie3. Das Vorhandensein nicht deklarierter oder falsch identifizierter botanischer Arten kann zu einer verminderten Wirksamkeit oder sogar zu Sicherheitsproblemen führen. Zum Beispiel, schwarze Cohosh (Actaea racemosa), zur Behandlung von prämenstruellen Beschwerden verwendet, kann mit einer günstigen asiatischen Art mit begrenzten klinischen Daten Unterstützung für seine Wirksamkeit ersetzt werden4. In einem ernsteren Fall führte die Substitution von Aristolochia fangchi für Stephania terandra in einer klinischen Studie zur Gewichtsabnahme mit chinesischen Kräutern bei einigen Teilnehmern zu schwerer Nephrotoxizität und Nierenversagen bei einigen Teilnehmern5,6. Die beiden verschiedenen Arten teilten sich den chinesischen gemeinsamen Namen “Fang Ji”. Diese Fälle unterstreichen die Notwendigkeit einer strengeren Qualitätskontrolle, beginnend mit der Identifizierung von Rohstoffen7, vorzugsweise so nah wie möglich am Ursprungsort der Lieferkette, so dass Ressourcen effizient dem Material der richtigen Identität zugeordnet werden können.

Zur botanischen Identifizierung kann eine Reihe von orthogonalen Ansätzen verwendet werden. Traditionell wird die botanische Identifizierung durch morphologische Bewertung8,9 und chemische Analysemethoden10,11,12,13durchgeführt. Die morphologische Identifizierung basiert auf Unterschieden in makroskopischen und mikroskopischen Merkmalen von Pflanzenmaterialien, wenn Unterschiede bestehen (Abbildung 1). Allerdings hat der Mangel an Trainingsprogrammen zur klassischen Botanik in den letzten Jahren zu einem Mangel an Experten geführt14, was diesen Ansatz für die routinemäßige Qualitätskontrolle unpraktisch macht. Seine Anwendung in pulverförmigen botanischen Materialien ist auch begrenzt. Chemische Analysemethoden sind weit verbreitet in Arzneibüchern und Laboratorien, aber nicht ideal für Feldtests aufgrund der Größe von Instrumenten wie High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), High Performance Liquid Chromatography (HPLC), und Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) (Abbildung 2), und Umgebungsanforderungen. In jüngster Zeit haben sich genomische Methoden als alternative Technik für die Authentifizierung und Substitutionsdetektion botanischer Arten herausgebildet und haben sich als effizient und präzise erwiesen. Genomische Methoden nutzen die hohe Genauigkeit und Spezifität genetischer Informationen in Pflanzenmaterialien15,16,17,18,19. Molekulardiagnostische Tools sind in Form von tragbaren Geräten verfügbar und umfassen oft automatisierte Dateninterpretationstools, die die Barriere für den Einsatz von Technologie senken, was diesen Ansatz ideal für die Feldidentifikation20,21,22,23,24macht. Sobald die molekulare Analysemethode entwickelt und validiert wurde25,26,27, kann sie von jedem Personal mit molekularbiologischem Grundtraining durchgeführt werden. Unter den verschiedenen tragbaren Werkzeugen zur Verfügung, Echtzeit-PCR auf DNA-Sequenzen ist eine der kostengünstigen Entscheidungen28. Die Kombination eines tragbaren Geräts, zusammen mit einer maßgeschneiderten und validierten molekularen Analyse, ermöglicht die Überprüfung botanischer Arten und Inhaltsstoffe außerhalb des Labors, z. B. in Farmen und Lagern für botanisches Material, wodurch die Zeit und die Kosten im Zusammenhang mit herkömmlichen Methoden reduziert werden.

Ziel dieses Protokolls ist die Einführung einer Methode zur botanischen Identifizierung in Situationen, in denen der Zugang zu Laborgeräten und Fachwissen mit einem tragbaren qPCR-System eingeschränkt oder nicht verfügbar ist. Die Methode wird auf einem Feld von Matricaria chamomilla (Abbildung 3A), allgemein bekannt als deutsche Kamille, weit verbreitet für seine entzündungshemmende und antioxidative Eigenschaften29verwendet. Es kann mit verwandten Arten von ähnlichem Aussehen oder Geruch verwechselt werden, vor allem aus den Gattungen Chamaemelum, Tanacetumund Chrysanthemum30,31,32. Unter den verwandten Arten ist Chamaemelum nobile, auch bekannt als römische Kamille, eine bemerkenswerte mit vergleichbaren Produktionsniveaus im Handel (Abbildung 3B). Die gezeigte Methode wurde entwickelt, um nicht nur die Zielbotanische Art M. chamomillazu identifizieren, sondern auch ihre nahe Verwandte, C. nobile, basierend auf einer spezifischen Amplifikation von DNA-Sequenzen zu identifizieren.

In diesem Artikel wird ausführlich erläutert, wie die feldbotanische Identifizierung von M. chamomilla mithilfe der interkalierenden farbbasierten qPCR- und Schmelzkurvenanalyse auf einem tragbaren Gerät durchgeführt wird. Das Protokoll umfasst die Sammlung von botanischen Proben aus dem Feld, die DNA-Extraktion vor Ort und die Einrichtung von Echtzeit-PCR-Reaktionen. Um eine valide Schlussfolgerung zu gewährleisten, werden Ziel botanische M. chamomilla und nicht-Ziel botanische C. nobile genomische DNA, vorextrahiert aus zertifizierten botanischen Referenzmaterialien, als positive Kontrolle verwendet. Die Spezifität dieser Methode wird durch die Durchführung von M. chamomilla und C. nobile Identifizierungstests einzeln an Proben und Kontrollen demonstriert. Nicht-Vorlage negative Kontrolle wird verwendet, um falsch positive Ergebnisse durch PCR-Kontamination verursacht auszuschließen.

Protocol

1. Probensammlung Richten Sie einen Testbereich im Feld mit einer flachen und horizontalen Fläche ein. Identifizieren Sie eine repräsentative Pflanze, die die Eigenschaften der Mehrheit der Pflanzen im Kamillenblütenfeld widerspiegelt (Abbildung 4). Wählen Sie einen Blütenkopf aus der repräsentativen Pflanze mit sterilen Handschuhen. Legen Sie die Probe in ein 2,0 ml Sammelrohr. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.4 und sammeln Sie eine Packungsbeilage (ca. 0,5–0,7 cm lang) von derselben Pflanze.HINWEIS: M. chamomilla Blume und Blatt sind klein genug, um am Boden eines 2,0 ml Sammelrohr zu sitzen. Für andere Pflanzen mit größerer Oberfläche kann ein Papierstanz oder eine Schere (vor der Verwendung in 70% Ethanol gespült) verwendet werden, um Gewebeproben für Tests zu isolieren. Wenn mehrere Proben erforderlich sind, spülen Sie den Papierstanz oder die Schere zwischen der Handhabung verschiedener Proben. 2. DNA-Extraktion Den Trockenbad-Inkubator auf 95 °C vorheizen. Fügen Sie jedem Sammelrohr 100 l der Extraktionslösung aus dem Pflanzen-DNA-Extraktionskit hinzu (in Tabelle der Materialienaufgeführt ). Für eine bessere DNA-Extraktionseffizienz, schleifen Sie die Gewebeprobe in der Extraktionslösung mit einem Gewebeschädling. Schließen Sie die Röhre. Stellen Sie sicher, dass das botanische Gewebe während des extraktionsgemäßen Extraktionsprozesses mit der Extraktionslösung bedeckt ist. Legen Sie die Sammelrohre in einen vorgeheizten Trockenbad-Inkubator und bebrüten die Sammelrohre 10 min bei 95 °C. Nach 10 min die Schläuche aus dem Trockenbad-Inkubator nehmen. Fügen Sie 100 l der Verdünnungslösung aus dem gleichen DNA-Extraktionskit hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen. Wiederholen Sie den gleichen Schritt für die Extraktion von Packungsbeilagen. Schütteln Sie, um die Lösung weiter zu mischen. Das Pflanzengewebe scheint nach dieser Behandlung in der Regel nicht abgebaut zu werden. Die flüssige Farbe kann sich ändern und trüb werden.HINWEIS: Die verdünnte Lösung kann bei Raumtemperatur über Nacht gelagert werden, wenn sie nicht sofort vorankommt. Es ist nicht notwendig, die zellulären Ablagerungen aus Pflanzengewebe vor der Lagerung zu entfernen. Die Flüssigkeit in den Röhrchen hält die DNA-Vorlagen für die nachgeschaltete PCR-Verstärkung. 3. PCR-Reaktions-Setup Konfigurieren Sie die thermocycling-Bedingungen des qPCR-Instruments gemäß den Spezifikationen des Herstellers. Wenden Sie das in Tabelle1aufgeführte PCR-Thermocyclingprofil an, das mit einem konstanten Temperaturschritt für die anfängliche Denaturierung beginnt, gefolgt von 25 Zyklen der Verstärkung, und endet mit Temperaturrampen, um eine hochauflösende Schmelzkurve zu erhalten. Den qPCR Master Mix und primer (Tabelle 2) vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen. Planen Sie die Reaktion, die in jedem Brunnen geladen wird: Brunnen mit positiver Kontrolle mit Zielarten, Positive Kontrolle mit Nichtzielarten, Proben und Negativkontrolle (Abbildung 5). In diesem Beispiel werden zehn Brunnen verwendet – fünf für den deutschen Kamillen-Identifikationstest und die restlichen fünf für den römischen Kamillen-Identifikationstest. Für jede Art von Artenidentifizierungstest enthält ein Brunnen eine positive Kontrolle mit DNA, die aus dem Referenzmaterial der zielgerichteten Art extrahiert wurde, eine Bohrung enthält eine positive Kontrolle mit DNA, die aus dem Referenzmaterial nicht zielgerichteter Arten extrahiert wurde, zwei Brunnen werden mit Aush. aus dem Feld extrahierten Blumen- und Blatt-DNA-Proben gefüllt, und ein Brunnen wird für eine negative Kontrolle zugeordnet. Tabelle 3 beschreibt jeden Brunnentyp. Bereiten Sie einen Reaktionsmaster-Mix gemäß dem Handbuch für jeden Botanischen Arten-Identifikationstest vor. Ein typischer Reaktionsmaster-Mix enthält universellen qPCR Master Mix (2x), vorwärts- und rückwärts artspezifische Primer und nukleasefreies Wasser. In Tabelle 4 ist die Zusammensetzung des Reaktionssystems aufgeführt.HINWEIS: Wenn Sie die qPCR-Reaktionsmaster-Mischung nicht sofort verwenden, bei +2 °C bis +8 °C in einem Kühler oder Mini-Kühlschrank aufbewahren. Mischen Sie den Reaktionsmaster-Mix vor Gebrauch gründlich durch Pipettieren. Legen Sie die qPCR-Patrone nach oben auf eine flache und stabile Oberfläche. Laden Sie 18 l des in Schritt 3.4 konfigurierten Reaktionsmaster-Mix in die Kartuschenbohrungen gemäß den in Schritt 3.3 definierten Bohrungen. Für diese Vorführung fügen Sie den deutschen Kamillen-Identifikationstest-Reaktions-Master-Mix in Brunnen ein, die für den GC-Test gekennzeichnet sind (GCT in den Brunnen 1, 3, 5, 7, 9) und den römischen Kamillen-Identifikationstest-Test-Master-Mix in Für den RC-Test gekennzeichnete Brunnen (RCT in Denbrunnen 2, 4, 6, 8, 10) (siehe Abbildung 5). Übertragen Sie 2 L Proben-DNA aus dem Überstand von DNA-Extraktionsröhrchen und vorextrahierten DNA-Positivenkontrollen in Kartuschenbrunnen, die mit qPCR-Master-Mix vorinstalliert sind. Nachdem Sie jede DNA-Vorlage zum qPCR-Mastermix hinzugefügt haben, mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren.HINWEIS: Vermeiden Sie schwimmende Zellablagerungen, wenn SIE DNA aus der DNA-Extraktionsröhre übertragen. Verwenden Sie Minizentrifuge, um den Überstand und zellulären Schmutz zu trennen, wenn nötig. Versiegeln Sie die Patrone vorsichtig mit Klebefolie. Legen Sie die Patrone auf die Thermocyclingkammer und schließen Sie sie. Legen Sie die Ausführung des qPCR-Instruments fest.

Representative Results

Nach dem in Abschnitt 1 beschriebenen Protokoll wurden botanische DNA aus Blütenkopf und Blatt nach Hitzeinkubation des Sammelrohrs bei 95 °C für 10 min in den Überstand extrahiert. In der aktuellen Studie zeigte der Überstand eine gelbe und grünliche Farbe für Blüte und Blatt, was darauf hindeutet, dass eine Vielzahl natürlicher Verbindungen mit botanischer DNA in den Überstand freigesetzt wurden (Abbildung 6). Obwohl eine zuverlässige PCR-Verstärkung später in Dreifacharbeit für alle feldextrahierten DNA-Vorlagen erreicht wurde, wurde im Labor eine DNA-Qualitätsbewertung als Referenz durchgeführt. Die Konzentration des durch Fluorometrie ermittelten Zellkopf-DNA-Extrakts lag zwischen 3,69–5,36 ng/l, während die Konzentration des Blatt-DNA-Extrakts zwischen 6,42 und 9,29 ng/l lag. Die Absorptionsverhältnisse A260/A280 und A260/A230 von Blüten- und Blatt-DNA-Extrakten wurden mittels Spektrophotometrie gemessen. Aufgrund der Überlappung zwischen DNA und phytochemischem UV-Absorptionsspektrum konnten diese Verhältnisse jedoch nicht zuverlässig gemessen werden (Daten nicht dargestellt). Intercalating fluorescent dye wurde verwendet, um die Verstärkung von Zielfragmenten in Echtzeit zu überwachen. Da sowohl die spezifischen Primer M. chamomilla als auch C. nobile auf den internen transkribierten Abstandshalter 2 (ITS2) abzielen, der Zehner bis Hunderte von Kopien im Pflanzengenom hat, reichen 25 PCR-Amplifikationszyklen aus, um genügend Amplicons für die Identifizierung von Kamillenarten zu erzeugen. In Abbildung 7betrug der Ct-Wert für m. chamomilla-Positivkontrolle im M. chamomilla-Identifikationstest weniger als 25 (GCP_GCT, während nach 25 Amplifikationszyklen die Fluoreszenz derselben Kontrolle im C. nobile-Identifikationstest unter der Nachweisschwelle lag (GCP_RCT). Auf der anderen Seite lag die Fluoreszenz für die C. nobile Positivkontrolle bei M. chamomilla-Identifikationstest nach 25 Zyklen unter der Nachweisschwelle (RCP_GCT), während der Ct-Wert für die gleiche Kontrolle im C. nobile-Identifikationstest weniger als 25 (RCP_RCT) betrug. Die Verstärkung von Ziel- und Nichtziel-Positivkontrollen in ihren jeweiligen Assays zeigt die Spezifität des M. chamomilla Identification Assays. Für Proben-DNA, Feldblütenkopf und Blatt-DNA-Extrakt ergaben Ct-Werte von 15,18 bzw. 19,41 in M. chamomilla-Identifikationstest, bzw. (Sample1(FLOWER)_GCT und Sample2(LEAF)_GCT). Beide Proben wurden nicht im C. nobile-Identifikationstest (Sample1(FLOWER)_RCT und Sample2(LEAF)_RCT) verstärkt. Die Amplifikationsmuster beider Proben entsprachen dem Amplifikationsmuster von M. chamomilla positiv. Negative Kontrollen wurden sowohl bei M. chamomilla als auch bei C. nobile-Identifikationstests (NC_GCT und NC_RCT nicht verstärkt, mit Ausnahme der Möglichkeit falscher Positivmeldungen, die durch PCR-Kontamination verursacht wurden. Um die spezifische Amplifikation in positivkontrollierten und Proben weiter zu bestätigen, wurden Fraktionen des PCR-Endprodukts aus jedem Bohrgut auf 2% Agarose-Gel im Labor ausgeführt (Abbildung 8). Für den M. chamomilla-Identifikationstest ergaben beide Feldproben Amplicons, die an der gleichen Position wie die M. chamomilla-Positivkontrolle mit einer geschätzten Größe von etwas über 100 bp (theoretische Größe 102 bp) liefen. Für den C. nobile-Identifikationstest ergab die Nichtzielart C. nobile eine Bandbreite zwischen 50 und 100 bp, die der theoretischen Größe von 65 bp entspricht. Die übrigen Bahnen wiesen kein spezifisches Amplifikationsprodukt auf, das mit dem Fehlen eines fluoreszierenden Signals für diese Brunnen einverstanden war, wie bei Feldversuchen festgestellt wurde. Nach der PCR-Verstärkung wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die Dissoziationseigenschaften von doppelsträngiger DNA (dsDNA) während des Erhitzens zu bewerten. Als die Temperatur während des letzten Zyklus für die Schmelzkurvenanalyse anstieg, führte der Temperaturanstieg dazu, dass sich die Doppelstrangamplicons lösten. Der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff wurde nach und nach in die Lösung freigesetzt, wodurch die Fluoreszenzintensität verringert wurde (Abbildung 9A). Der Wendepunkt der ersten Derivatkurve wurde verwendet, um die Schmelztemperatur (Tm) zu bestimmen (Abbildung 9B), die hauptsächlich von der Länge des DNA-Fragments und dem GC-Gehalt abhängt. Die Kombination des Ct-Werts mit der Schmelztemperatur kann die Spezifität der qPCR-Analyse erhöhen. In der aktuellen Studie trat der Schmelztemperatur-Peak von M. chamomilla positiv kontrolliertPCR Amplicon bei 85,6 °C (GCP_GCT) auf und unterschied sich von der Schmelztemperaturspitze von C. nobile Positivkontrolle PCR Amplicon bei 79,1 °C (RCP_RCT). Das PCR-Amplicon aus Feldblütenkopf und Blatt erzeugte Schmelztemperaturspitzen bei 85,2 °C bzw. 84,8 °C (Sample1(FLOWER)_GCT und Sample2(LEAF)_GCT). Zur Beurteilung der mit dem tragbaren qPCR-System gemessenen Schmelztemperaturschwankungen wurden zusätzliche Datenpunkte gesammelt, um zu bestätigen, dass die Probenschmelztemperaturen immer nahe an der Schmelztemperatur von M. chamomilla positiv waren (innerhalb von 2 °C) und weit von der Schmelztemperatur von C. nobile positivkontrollamplicon entfernt waren (Abbildung 10). Schmelztemperaturspitzen wurden manchmal in anderen Brunnen gemeldet. Ihre Ct-Werte lagen jedoch nicht unter 25 und die Schmelztemperaturspitzen lagen nicht in der Nähe von M. chamomilla oder C. nobile positiv (mehr als 2 °C auseinander). Zusammenfassend lässt sich das Feld M. chamomilla identification test auf der Grundlage von Entscheidungsregeln interpretieren, die in Tabelle 5zusammengefasst sind. Da alle positiven Kontrollen positiv auf die vermeintliche botanische Art getestet wurden, negativ für die anderen Arten, und negative Kontrollen negativ, wurden beide Feldproben bestimmt, um M. chamomilla, aber nicht C. nobileenthalten. Um die Ergebnisse der Feldversuche mit anderen Analysetechniken in Einklang zu bringen, wurden die Feldergebnisse durch eine zuvor validierte DNA-Barkodierungsmethode25 (daten nicht gezeigt) bestätigt. Abbildung 1: Morphologische Identifizierung botanischer Materialien. (A) Hibiscus rosa-sinensis Blüten, Curcuma longa Wurzeln, Malva Sylvestris Blätter, Rosmarinus officinalis Blätter, Coriandrum sativum Samen, Zingiber officinale Wurzeln. (B) Petroselinum crispum und Apium graveolens Flocken sind schwer zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Chemische Identifizierung botanischer Materialien. (A) HPTLC-Instrument und ein repräsentatives HPTLC-Chromatogramm. (B) HPLC-Instrument und ein repräsentatives HPLC-Chromatogramm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Matricaria chamomilla und Chamaemelum nobile auf dem Feld. (A) Matricaria chamomilla, adaptiert von Wikipedia unter CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg. (B) Chamaemelum nobile, adaptiert von Wikipedia unter CC BY-SA 3.0, https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Sammeln von M. chamomilla Pflanzenteilen aus dem Feld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Layout der Testbohrungen in der Demo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Feld-DNA-Extrakt in Sammelröhrchen. Botanisches Gewebe verbleibt in der Originalröhre und ist mit gelblichem DNA-Extrakt bedeckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Fluoreszenzdiagramm, das die Ansammlung von PCR-Produkten über 25 Zyklen des Thermocyclings zeigt. M. chamomilla positive Kontrolle und C. nobile positive Kontrolle zeigen Ct Werte weniger als 25 in M. chamomilla und C. nobile Identifikationstests, beziehungsweise. Die Feldblumen- und Blattproben wurden durch den M. Chamomilla-Identifikationstest mit den Ct-Werten von 15.18 und 19.41 verstärkt. Der Rest der Brunnen wurde nicht verstärkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Gelelektrophorese von Feld-PCR-Amplifikationsprodukten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: Schmelztemperaturanalyse. (A) Das Fluoreszenzsignal in jedem Brunnen nimmt mit der steigenden Temperatur ab. (B) Die Identität der PCR-Produkte wurde durch den Schmelztemperaturspitzen in der Schmelzkurvenanalyse bestätigt. Die Feldblumen- und Blattproben zeigen Spitzen bei 85,2 °C und 84,8 °C. Diese sind in der Nähe des Gipfels von M. chamomilla positive Kontrolle produziert. Die C. nobile Positivkontrolle erzeugte einen Spitzenwert von 79,1 °C, der sich von den anderen drei Proben unterscheidet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 10: Temperaturschwankungen zwischen Positivsteuerung und Feldproben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Bühne Zyklus Temperatur Zeit Konstante Temperatur 1 95 °C 60er jahren Verstärkung 25 95 °C 30er jahren 60 °C 30er jahren Schmelzkurve 1 60 °C Rampe 0,05 °C/s 95 °C Tabelle 1: qPCR-Thermocycling-Bedingungen für M. chamomilla und C. nobile-Identifikationstests. Probe Primername Sequenz 5′-3′ Position Region Amplicon Größe Matricaria recutita ZL3 TCGTCGGTCGCAAGGATAAG vorwärts ITS2 102 bp ZL4 TAAACTCAGCGGGTAGTCCC Rückwärts Chamaemelum nobile ZL11 TGTCGCACGTTGCTAGGAAGCA vorwärts ITS2 65 bp ZL12 TCGAAGCGTCATCCTAAGACAAC Rückwärts Tabelle 2: Primerpaare für M. chamomilla und C. nobile Identifikationstests. Gute Position Brunnenname Beschreibung 1 GC_PosCtrl_GC_Test Deutsche Kamille-Positivkontrolle im GC-Test 2 GC_PosCtrl_RC_Test Deutsche Kamille-Positivkontrolle im RC-Test 3 RC_PosCtrl_GC_Test Römische Kamille-Positivkontrolle unter GC-Test 4 RC_PosCtrl_RC_Test Römische Kamille-Positivkontrolle unter RC-Test 5 Field_Sample_GC_Test Probe von Blattgewebe im GC-Test 6 Field_Sample_RC_Test Probe von Blattgewebe unter RC-Test 7 Field_Sample_GC_Test Probe von Blütengewebe im GC-Test 8 Field_Sample_RC_Test Probe von Blumengewebe unter RC-Test 9 NegCtrl_GC_Test Negative Kontrollprobe unter GC-Test 10 NegCtrl_RC_Test Negative Kontrollprobe unter RC Test Tabelle 3: Brunnentypen und Beschreibungen für M. chamomilla und C. nobile Identifikationstests. Reagenz GC_Test RC_Test Universell erqPCR Mix* 10 l 10 l ZL3-Grundierung (10 m) 0,4 l Na ZL4-Grundierung (10 m) 0,4 l Na ZL11 Grundierung (10 x M) Na 0,4 l ZL12-Grundierung (10 m) Na 0,4 l H2O (Nukleasefrei) 7,2 l 7,2 l * enthält Hot Start Taq DNA Polymerase Tabelle 4: Master-Mix-Zusammensetzung für M. chamomilla und C. nobile Identifikationstests. Well Name Erwartetes Ergebnis Positive Ergebniskriterien Negative Ergebniskriterien Detektiert / vorhanden Nicht erkannt / abwesend GC_PosCtrl_GC_Test Erkannt Ct < 25 und 84 <= Tm <= 86 – GC_PosCtrl_RC_Test Nicht erkannt – Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen RC_PosCtrl_GC_Test Nicht erkannt – Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen RC_PosCtrl_RC_Test Erkannt Ct < 25 und 79 <= Tm <= 81 – Field_Sample_Leaf_GC_Test Präsent Ct < 25 und 84 <= Tm <= 86 Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen Field_Sample_Leaf_RC_Test Abwesend – Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen Field_Sample_Flower_GC_Test Präsent Ct < 25 und 84 <= Tm <= 86 Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen Field_Sample_Flower_RC_Test Abwesend – Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen NegCtrl_GC_Test Nicht erkannt – Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen NegCtrl_RC_Test Nicht erkannt – Kein Ct-Wert innerhalb von 25 Zyklen Tabelle 5: Regeln für die Interpretation des qPCR-Ergebnisses.

Discussion

Das Design von Primern und die Vorlagenauswahl sind die entscheidenden Schritte, um eine effiziente und spezifische qPCR-Verstärkung zu erhalten. Nach der Identifizierung einer geeigneten Vorlage wird die Primer-Design-Software in der Regel verwendet, um die Auswahl von Primern basierend auf Konstruktionsvariablen wie Primerlänge, Schmelztemperatur und GC-Inhalt33,34zu unterstützen. Optimierung und Validierung können unter den erwarteten experimentellen Bedingungen des Assays durchgeführt werden, um Spezifität, Empfindlichkeit und Robustheit einer PCR-Reaktion zu gewährleisten35. Das suboptimale Primerdesign kann zu einer Primer-Dimer-Bildung führen, wobei Primer-Wechselwirkungen unspezifische Produkte erzeugen36.

Die in dieser Studie verwendeten No Template Controls (NTC) prüfen sowohl die DNA-Kontamination als auch das Vorhandensein von Primer-Dimern, die den Test beeinflussen könnten. Die Ergebnisse zeigten keine Amplifikation, ein guter Hinweis darauf, dass sowohl DNA-Kontamination als auch Primer-Dimere kein Problem darstellen. DNA-Kontamination und Primer-Dimere manifestieren sich in Schmelzkurven durch keine Vorlagensteuerungen und als zusätzliche Spitzen in Schmelzkurven positiver Kontrollen. In der Regel wird erwartet, dass die Schmelzkurve einer positivgesteuerten Steuerung einen einzelnen Peak enthält, es sei denn, AT-reiche Subdomänen in der Vorlage verursachen ungleichmäßiges Schmelzen. Doppelte Spitzen könnten durch die Simulation von Schmelztests mit der uMELT-Software37vorhergesagt werden. In dieser Studie wurde der Goldstandard für den Betrieb des PCR-Produkts auf Agaro-Gel verwendet, um das Vorhandensein von Ziel-PCR-Produkt und das Fehlen von Kontamination und Primer-Dimer zu bestätigen.

Eine große Herausforderung in der molekularen Analyse des botanischen Materials besteht darin, nach dem botanischen DNA-Extraktionsprozess eine qualitativ hochwertige DNA zu erhalten. Botanische Materialien werden für die aktiven chemischen Verbindungen gehandelt und verbraucht, die mit gesundheitlichen Vorteilen verbunden sind. Im Prozess der DNA-Extraktion werden diese chemischen Verbindungen auch in die DNA-Extraktionslösung freigesetzt, was möglicherweise pcR-Hemmung verursacht, was zu Ausfällen bei der PCR-Verstärkung führt. Verschiedene Pflanzen-DNA-Reinigungskits mit organischen Lösungsmitteln und Säulen wurden entwickelt, um chemische Verbindungen aus pflanzlichen Stoffen zu entfernen38. Die zur Unterstützung dieser Kits erforderliche Rauchhaube und Hochgeschwindigkeitszentrifuge sind jedoch nicht im Feld verfügbar.

Im aktuellen Protokoll verwendet die vereinfachte DNA-Extraktionsmethode ein kommerzielles Pflanzen-DNA-Extraktionskit (Details siehe Tabelle der Materialien). Es hatte die Fähigkeit, gemeinsame hemmende Substanzen für reproduzierbare Ergebnisse zu neutralisieren und produzierte konsistente Ergebnisse für M. chamomilla und C. nobile. Sowohl M. chamomilla und C. nobile Blütenköpfe und Blätter ergaben PCR-Amplicons mit spezifischen Schmelzspitzen, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von PCR-Hemmern kein Problem war. Bei anderen Pflanzen mit höheren KONZENTRATIONen von PCR-Inhibitoren kann die Verstärkung der DNA in ihrer ursprünglichen Extraktion weniger effizient sein. Um die Hemmung zu reduzieren und die Amplifikationseffizienz zu verbessern, können mit Zugang zur gesamten Anlage auch andere Pflanzenteile mit geringerem Polysaccharid- und Polyphenolgehalt zur Identifizierung verwendet werden. Wenn es begrenzten Zugang zu verschiedenen Pflanzenteilen gibt, können jüngere Blätter oder Blütenblätter, die von Blütenköpfen seziert werden, die typischerweise einen niedrigeren Phenolgehalthaben 39, eine bessere Chance auf Erfolg bieten. Da DNA-Sequenzen über die gesamte Pflanze konsistent sind, kann jeder Pflanzenteil verwendet werden, um die Identität der Arten zu bestätigen. Wenn die PCR-Verstärkung noch suboptimal ist, kann der ursprüngliche DNA-Extrakt weiter verdünnt werden, bevor PCR verwendet wird, oder es können anspruchsvollere Laborreinigungsprotokolle verwendet werden.

Eine weitere Herausforderung für die PCR-Analyse sind falsch positive Ergebnisse, die durch DNA-Kontamination verursacht werden, was sich negativ auf die Dateninterpretation auswirken kann. Es wird in der Regel durch aktive Haushaltsführung, mit speziellen Geräten und die Beschränkung der Arbeit auf bestimmte Bereiche gesteuert. Mit qPCR kann die gesamte PCR-Analyse in einem geschlossenen System durchgeführt werden, was die Wahrscheinlichkeit einer PCR-Amplikonkontamination in einer Umgebung, die nicht gut kontrolliert ist, erheblich reduziert. Außerdem sollte Umwelt-DNA aufgrund der Spezifität des Tests auch kein falsch positives zeigen, so eine frühere Validierungsstudie40.

Es gibt Raum für Verbesserungen. In dem hier vorgestellten Protokoll wurde interkalierender Farbstoff verwendet, um die Zielfragmentverstärkung in Echtzeit zu zeigen. Die Spezifität des Verfahrens wird durch die charakteristische Schmelztemperatur bestätigt, die sich zwischen M. chamomilla und C. nobile Amplicons unterscheidet. Daher kann interkalierende, auf Farbstoffen basierende PCR die Frage “Was ist diese Pflanzenart?” auf dem Gebiet effizient beantworten. Neben der Notwendigkeit, eine botanische Identifizierung an einer einzigen vom Feld isolierten Pflanze durchzuführen, werden in vielen Fällen auch botanische Pulver oder Extrakte im Lager von einer schnellen Identitätsbewertung vor Ort profitieren. Für diese Art von Materialien müssen möglicherweise zusätzliche Fragen beantwortet werden, wie z. B. “Was ist in diesem Material?”, “Enthält es die botanischen Arten, die ich suche?”, “Enthält es Ehebrecher, die ich vermeiden möchte?” und “Wird es ganz oder teilweise durch andere botanische Arten ersetzt, die schädlich sind?”. Anstatt interkalierenden Farbstoff zu verwenden, können verschiedene qPCR-Sonden entwickelt werden, um Amplicons aus verschiedenen pflanzlichen Stoffen in einem Reaktionssystem zu zielen, während eine hohe Spezifität und Effizienz des Tests beibehalten wird. Die Entwicklung von sonsweiter qPCR und die Nutzung eines tragbaren qPCR-Systems, das eine Mehrkanalerkennung bietet, können die Anwendung von Feldtests als zweckdienlichen Test auf eine breitere Umgebungsumgebung, wie z. B. Lager für botanisches Material und Distributionszentren, weiter ausdehnen, um kompliziertere Fragen zu beantworten. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung mehrerer Sonden dem Benutzer auch die interne Verstärkung in jedes Reaktionssystem, so dass mehr Informationen verfügbar sind, wenn PCR-Hemmung vermutet wird.

Das hier vorgestellte Protokoll hat im Vergleich zu bestehenden Technologien, die für denselben Zweck verwendet werden, folgende Vorteile. Erstens müssen bei traditionellen morphologischen und chemischen Identifizierungsmethoden das Verfahren und seine Ergebnisse von Sachverständigen durchgeführt und interpretiert werden. qPCR-basierte Identifikationstests können von Personen mit molekularbiologischer Grundausbildung durchgeführt und standardisiert interpretiert werden. Zweitens erfordert das Feldidentifikationsprotokoll mit einem tragbaren Instrument im Vergleich zur qPCR-basierten Artenidentifizierung und -differenzierung, die normalerweise im Labor durchgeführt wird, keine Instrumente mit großem Platzbedarf, wie z. B. eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, EINE DNA-Qualitätsbewertungsausrüstung, einen thermischen Cycler mit Fluoreszenzdetektor und einen Computer, auf dem eine spezielle Software ausgeführt wird. So kann die DNA-basierte Artenidentifikation in jeder Umgebung ohne Verzögerung durchgeführt werden. Drittens ist die Suche nach botanischen Materialien eine Aufgabe, die eine globale Operation erfordert. Mit Fortschritten in den Bereichen Cloud-Dienste und künstliche Intelligenz kann ein tragbares Gerät potenziell Methoden erhalten, die von Experten im Labor entwickelt und validiert werden, von Nicht-Experten in abgelegenen Gebieten betrieben werden und objektive Zertifizierungen von Dritten erstellen. Daher ist diese Option überzeugender als je zuvor, da Remote-Arbeit zum Trend wird.

Zusammenfassend zeigt das Protokoll hier die Feldidentifikation von M. chamomilla mit einem tragbaren qPCR-System. Die erfolgreiche Anwendung dieser Technik wird hochgenaue Ergebnisse bei der botanischen Identifizierung liefern und botanischen Herstellern und Lieferanten helfen, botanische Materialien zeitnah und kosteneffizient zu qualifizieren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken James Shan für seine Bemühungen bei der Videoaufzeichnung vor Ort. Wir danken Jon Byron und Matthew Semerau für ihre Arbeit in der Videobearbeitung. Wir danken Ansen Luo, Harry Du und Frank Deng für ihre Unterstützung bei der Suche nach dem Testfeld. Wir danken Maria Rubinsky für ihre wertvollen Kommentare zum gesamten Manuskript. Alle anerkannten Personen sind Mitarbeiter von Herbalife International of America, Inc.

Materials

Battery TNE 78000mAh Provide field power supply
bCUBE HYRIS bCUBE 2.0 Portable qPCR instrument
Cartridges(16 Well) HYRIS NA Consumables for bCUBE
Electric pipette Eppendorf NA Handling liquid
Extract-N-AmpTM plant PCR kit SIGMA XNAP2-1KT Plant DNA extraction kit
German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials AHP 2264 Used as positive control
Mini dry bath Yooning MiniH-100L For DNA extraction
Nuclease-free water AMBION AM9937 qPCR reaction
Primer Thermo Fisher Scientific NA qPCR reaction
Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials ChromaDex ASB-00030806-005 Used as positive control
Luna universal qPCR master mix NEB M3003L qPCR reaction
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References

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Yang, Z., Quan, Z., Chua, T., Li, L., Zhang, Y., Babajanian, S., Buongiorno, F., Noce, I. D., Colombo, L., Newmaster, S., Chua, T., Chang, P., Swanson, G., Lu, Z. Field Identification of Matricaria chamomilla using a Portable qPCR System. J. Vis. Exp. (164), e60940, doi:10.3791/60940 (2020).
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