使用便携式 qPCR 系统对 马特里卡里亚查莫米拉进行现场识别

按照第1节所述的协议，在收集管在95°C下热孵育10分钟后，从花头和叶子中提取植物DNA进入上经剂中。在目前的研究中，上流剂显示了花和叶的黄色和绿色，表明各种天然化合物通过植物DNA释放到上流剂中（图6）。虽然后来在所有现场提取的DNA模板的三联法中实现了可靠的PCR扩增，但DNA质量评估在实验室中作为参考进行。由氟学测定的花头DNA提取物的浓度范围为3.69~5.36纳克/μL，而叶头DNA提取物的浓度范围为6.42~9.29纳克/μL。通过分光光度测量花和叶DNA提取物的A 260 /A 280和 A 260 /A 230 吸收比。280 260然而，由于DNA和植物化学UV吸收光谱之间的重叠，这些比率无法可靠地测量（数据未显示）。 用于实时监测目标片段的放大。由于特定的底法M.chamomilla和C.nobile都瞄准了内部转录的分版空间2（ITS2）区域，该区域在植物基因组中有数十到数百份拷贝，因此25个PCR扩增周期足以产生足够的安普利森，用于识别洋甘菊物种。在图7中，M. chamomilla识别测试中M.chamomilla阳性控制的Ct值小于25 （GCP_GCT），而经过25个放大周期后，C.nobile识别测试中同一对照的荧光低于检测阈值（GCP_RCT）。另一方面，经过25个周期后，M. chamomilla识别测试中C.nobile阳性控制的荧光低于检测阈值（RCP_GCT），而C.nobile识别测试中同一对C的C值小于25（RCP_RCT）。在各自的测定中对靶点和非靶向阳性对数的放大表明M.chamomilla鉴定测定的特异性。对于样本DNA，田花头和叶DNA提取物在M.chamomilla鉴定测试中分别产生15.18和19.41的Ct值（样本1（花）_GCT和样本2（LEAF）_GCT）。这两个样品在C.nobile鉴定测试（样本1（花）和样品2（LEAF）_RCT中未_RCT。两个样本的放大模式与M.chamomilla阳性对照的放大模式相匹配。在M.chamomilla和C.nobile鉴定测试C. nobile（NC_GCT和NC_RCT）中，阴性对比没有放大，排除了PCR污染导致的误报的可能性。为了进一步确认阳性对控和样品中的具体扩增，在实验室中，每井中每一个井的PCR最终产品的分数在2%的阿加罗斯凝胶上运行（图8）。对于M. chamomilla识别测试，两个现场样本都产生与M. chamomilla阳性对照相同的位置运行的 amplicons，估计大小略高于 100 bp（理论尺寸 102 bp）。对于C.nobile鉴定测试，非目标物种C.nobile阳性控制产生一个带在50和100bp之间，符合65个基点的理论大小。其余通道没有显示具体的放大产品，这与这些油井的荧光信号的缺乏一致，如现场测试所观察到的。 在PCR扩增之后，进行了熔融曲线分析，以评估加热过程中双链DNA（dsDNA）的分离特性。当熔体曲线分析的最后周期温度升高时，温度升高导致双链安普利森分离。中间荧光染料逐渐释放到溶液中，降低了荧光强度（图9A）。第一导数曲线的拐点用于确定熔融温度（Tm）（图9B），这主要取决于DNA片段长度和GC含量。将Ct值与熔化温度相结合，可提高qPCR分析的特异性。在目前的研究中 ，M. chamomilla 正控PCR放大器的熔融温度峰值发生在85.6°C（GCP_GCT），与79.1°C（RCP_RCT°C）的 C.nobile 正对PCR放大器的熔融温度峰值不同。田间花头和叶子的PCR放大器在85.2°C和84.8°C下产生熔融温度峰值（样本1（花）_GCT和样品2（LEAF）_GCT）。为了评估便携式 qPCR 系统测量的熔融温度变化，收集了额外的数据点，以确认样品熔化温度始终接近 从 M. chamomilla 阳性 控制（2 °C 内）获得的熔化温度，并且远离 C. nobile 正对安培的熔化温度（图10）。其他油井有时会报告熔化温度峰值。然而，它们的Ct值不低于25，熔化温度峰值不接近 M.chamomilla 或 C.nobile 正对照（相距超过2°C）。 总之，字段 M. chamomilla 识别测试可以根据表 5 中总结的决策 规则进行解释。由于所有阳性对子对试验均呈阳性，其他物种为阴性，阴性对子检测为阴性，因此两个现场样本均被确定为 含有M.chamomilla， 但不含 C.nobile。此外，为了使现场测试结果与其他分析技术保持一致，现场结论得到了先前验证的DNA条形码方法25 的进一步证实（数据未显示）。 图1：植物材料的形态鉴定。（A）芙蓉罗萨-西宁西斯花，柯尔库马龙加根，马尔瓦西尔维斯特里斯叶，罗斯马里努斯奥菲西纳利斯叶，科里安德鲁姆萨蒂夫姆种子，津吉伯奥西纳勒根。（B ） 石油精脆片和阿皮姆甲酸片很难区分。请单击此处查看此图的较大版本。 图2：植物材料的化学鉴定。（A） HPTLC 仪器和具有代表性的 HPTLC 色谱图。（B） HPLC 仪器和具有代表性的 HPLC 色谱图。 请单击此处查看此图的较大版本。 图3： 马特里卡里亚·查 莫米拉 和查梅梅卢姆· 诺比勒在外地。（A） 根据CC BY-SA 3.0改编的《马特里卡里亚·查莫米拉https://en.wikipedia.org/wiki/Matricaria_chamomilla#/media/File:Matricaria_February_2008-1.jpg。（B） 查梅梅鲁姆诺比勒，改编 自根据CC BY-SA 3.0的维基百https://en.wikipedia.org/wiki/Chamomile#/media/File:Chamaemelum_nobile_001.JPG。 请单击此处查看此图的较大版本。 图4：从现场收集M.查莫米拉植物零件。请单击此处查看此图的较大版本。 图5：试验井的布局演示。请单击此处查看此图的较大版本。 图6：采集管中的现场DNA提取物。植物组织保留在原始管中，并覆盖在黄色DNA提取物。 请单击此处查看此图的较大版本。 图7：荧光图显示PCR产品在25个循环的环循环中积累。M. chamomilla 阳性控制和 C. nobile 阳性控制分别显示 M. chamomilla 和 C. nobile 识别测试中的 Ct 值小于 25。田间花和叶样本通过 M.chamomilla鉴定 测试放大，Ct值为15.18和19.41。其余的油井没有放大。 请单击此处查看此图的较大版本。 图8：现场PCR扩增产品的凝胶电泳。请单击此处查看此图的较大版本。 图9：熔化温度分析。（A） 每一井的荧光信号随着温度的升高而降低。（B） 在熔融曲线分析中，熔融温度峰值证实了PCR产品的身份。田间花叶样品在85.2°C和84.8°C时显示峰值。 这些接近由M. 查莫米拉正对产生的 峰值。 C. nobile 阳性控制在 79.1 °C 时产生峰值，这与其他三个样本不同。 请单击此处查看此图的较大版本。 图10：正对照和现场样品之间的熔融温度峰值变化。请单击此处查看此图的较大版本。 阶段 周期 温度 时间 恒温 1 95 °C 60 年 代 放大 25 95 °C 30s 60 °C 30s 熔融曲线 1 60 °C 斜坡 0.05 °C/s 95 °C 表1：M.查莫米拉和 C.诺比勒识别试验的qPCR热循环 条件。 测定 底写名称 序列 5′-3′ 位置 地区 安培孔尺寸 马特里卡里亚·雷库蒂塔 ZL3 Tcgtcggtcggataag 向前 Its2 102 bp ZL4 塔卡特卡格塔格塔格克 反向 查梅梅卢姆 · 诺比勒 ZL11 特格特克卡格特格格塔加加加卡 向前 Its2 65 bp ZL12 特加格格特卡特卡加卡克 反向 表2：M.查莫米拉和C.诺比勒识别测试的底注对。 井位置 好名字 描述 1 GC_PosCtrl_GC_Test 德国洋甘菊在GC测试下阳性控制 2 GC_PosCtrl_RC_Test RC 测试下的德国洋甘菊阳性控制 3 RC_PosCtrl_GC_Test 在GC测试中对罗马洋甘菊进行阳性控制 4 RC_PosCtrl_RC_Test RC 测试下的罗马洋甘菊阳性控制 5 Field_Sample_GC_Test GC 测试下的叶组织样本 6 Field_Sample_RC_Test RC 测试下的叶组织样本 7 Field_Sample_GC_Test GC 测试下的花卉组织样本 8 Field_Sample_RC_Test RC测试下花卉组织样本 9 NegCtrl_GC_Test GC 测试下的负对控制样本 10 NegCtrl_RC_Test RC 测试下的负对控制样品 表3：M.查莫米拉 和C.诺比勒 识别 测试的井型和 说明。 试剂 GC_Test RC_Test 通用 qPCR 混合* 10 μL 10 μL ZL3 底明 （10 μM） 0.4 μL 那 ZL4 底是：10 μM） 0.4 μL 那 ZL11 底明（10 μM） 那 0.4 μL ZL12 底是：10 μM） 那 0.4 μL H2O （无核酶） 7.2 μL 7.2 μL * 包含热启动 Taq DNA 聚合酶 表4：M.查莫米拉 和C. 诺比勒识别 测试的主混合 组合。 好名字 预期结果 积极结果标准 负结果标准 已检测到/存在 未检测到/不存在 GC_PosCtrl_GC_Test 检测 Ct < 25 和 84 <\ Tm <= 86 – GC_PosCtrl_RC_Test 未检测到 – 25 个周期内无 Ct 值 RC_PosCtrl_GC_Test 未检测到 – 25 个周期内无 Ct 值 RC_PosCtrl_RC_Test 检测 Ct < 25 和 79 <\ Tm <= 81 – Field_Sample_Leaf_GC_Test 目前 Ct < 25 和 84 <\ Tm <= 86 25 个周期内无 Ct 值 Field_Sample_Leaf_RC_Test 缺席 – 25 个周期内无 Ct 值 Field_Sample_Flower_GC_Test 目前 Ct < 25 和 84 <\ Tm <= 86 25 个周期内无 Ct 值 Field_Sample_Flower_RC_Test 缺席 – 25 个周期内无 Ct 值 NegCtrl_GC_Test 未检测到 – 25 个周期内无 Ct 值 NegCtrl_RC_Test 未检测到 – 25 个周期内无 Ct 值 表5：qPCR结果解释规则。