RiboTag immunoprecipitatie in de kiemcellen van de mannelijke muis

Alle praktijken voor dierlijk gebruik en behandeling zijn goedgekeurd door het Comité interne dierenverzorging en -gebruik van de Rutgers University (IACUC). 1. Muizenfokkerij Ras vrouwelijke muizen homozygous voor een RNA bindende eiwitmutatie die leidt tot mannelijke onvruchtbaarheid (manuscript in voorbereiding, hierin aangeduid als het gen van belang) in trio paringen aan mannen hemizygous voor de Stra8-iCre allel (B6. FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ) (Cre+),als het koppelen van twee vrouwtjes aan elk mannetje verhoogt de fokefficiëntie.OPMERKING: Het mutante gen van belang (M) werd moederlijk gepasseerd, omdat vrouwtjes homozygous voor M een normale vruchtbaarheid hebben. Dit heeft als bijkomend voordeel dat de mannelijke kiemcel Cre (hemizygous) wordt toegelaten, zoals aanbevolen21 en het optimaliseren van het percentage nakomelingen met de gewenste allelic combinatie. Omdat homozygoot Cres kiemceltoxiciteit22vertonen, wordt aanbevolen het allel te onderhouden en door gegeven te worden in een heterozygoot of hemizygoottoestand. Belangrijk is dat cre-expressie niet meemag werken met het Rpl22-HA-allel tot de experimentele populatie. Het niet isoleren van het Rpl22-HA-allel van Cre bij fokdieren zal resulteren in nakomelingen die wereldwijd Rpl22-HA uitdrukken als gevolg van kiemcel Cre-activiteit. Dit probleem is specifiek voor kiemcel. Bovendien is de Stra8-iCre specifiek voor de celpopulatie van de auteurs van belang22, gericht op cellen die in en zeer vroeg in meiose overstappen, waaronder preleptoenen en leptotenen. Een andere Cre driver specifiek voor een ander type van de cel kan in plaats daarvan worden gebruikt. Gangde praktijk dicteert mannelijke kiemcel uitgedrukt Cres worden overgedragen aan de vaderlijke kant. Het is echter mogelijk dat de overdracht van de Stra8-iCre bij mannelijke nakomelingen kan worden weergegeven. Ongeacht het gekozen fokschema, moeten, om nakomelingen met gelijkwaardige Cre-expressie te genereren, alle experimentele monsters worden gegenereerd via Cre-transmissie van dezelfde ouderlijke kant (altijd moederlijk of altijd vaderlijk). Genotype resulterende mannelijke pups zoals beschreven in punt 2.4. Selecteer degenen die het M-allel dragen en positief zijn voor Cre (+/M:Cre+) voor downstream veredeling. Ras vrouwelijke muizen homozygous voor de M allel in trio paringen aan mannen homozygous voor Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ).OPMERKING: De Rpl22-HA achtergrond is zeer gemengd, dus zorg moet worden uitgeoefend bij de beoordeling van stam-specifieke fenotypes. Genotype resulterende vrouwelijke pups om te identificeren die het M-allel en positief voor Rpl22-HA (+/M:Rpl22-HA+) (zie punt 2.3). Selecteer deze vrouwtjes voor downstream fokken. Kruis +/M:Cre+ mannetjes met +/M:Rpl22+ vrouwtjes in trioparingen. Genotype de resulterende pups (zie de secties 2.3 en 2.4) om mannetjes te identificeren die zowel Cre+ als Rpl22+ en wildtype of M/M zijn.OPMERKING: Aangezien dit werk zich richt op een mutatie die resulteert in volledige mannelijke onvruchtbaarheid, zijn in het fokschema speciale overwegingen genomen om de gewenste experimentele genotypen zo efficiënt mogelijk te verkrijgen. Dergelijke overwegingen kunnen in andere experimentele modellen overbodig zijn. Zie figuur 2 voor een volledig fokschema en bijbehorende legende voor aanvullende bespreking van fokoverwegingen. 2. Monsterverzameling Verzamel proefzaadjes van mannelijke muizen op 21 dagen post-partum (dpp). Offer muizen op door CO 2-inademing, gevolgd door cervicale dislocatie. Maak een ventrale incisie (3 cm) op elk dier geflankeerd door twee kortere (2 cm per stuk), verbonden laterale incisies. Trek de huid en parimeer naar achteren om de teelballen te onthullen. Met behulp van tangen, trek de epidymale vet pad van de ene kant van de lichaamsholte om de epididymis en testis onthullen. Met tenotomy schaar, accijnzen de testis, zorg voor trim weg epididymis, omliggende vet, en een externe vasculatuur. Plaats intacte teelballen in een schone 1,7 mL buis. Herhaal dit met de andere kant en voeg de tweede teelballen toe aan de eerste buis. Sluit deze buis af en dompel deze onmiddellijk onder in vloeibare stikstof om te flash-freezeen.OPMERKING: Monsters kunnen tot gebruik bij -80 °C worden bewaard. Verzamel voor elk dier (2 mm) extra staarttipmonsters voor bevestiging van genotypering. Voeg 100 μL naoh van 50 mm mm toe aan een staartpunt van 2 mm in een buis van 1,7 mL en kook op 95 °C gedurende 30 min. Voeg 100 μL van 50 mM HCl en 20 μL van 1 M Tris-HCl pH 8,0 en centrifugemonsters gedurende 3 min bij 10.000 x g. Behoud supernatant (met genomisch DNA) en bewaar geëxtraheerd DNA bij 4 °C tot gebruik als sjabloon voor de volgende genotyperingsreacties. Rpl22-HA genotyping uitvoeren volgens een methode die is aangepast aan Sanz et al.13 met behulp van de volgende primers: 5′ GGGAGGCTTGCTGGATATG 3″; reverse: 5′ TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3′. Bereid een reactiemengsel bestaande uit 2 μL DNA zoals gewonnen in stap 2.2.1, 0,08 μL van 25 mM dNTP’s, 0,1 μL van 10 mM voorwaartse primer; 0,1 μL van 10 mM omgekeerde primer, 2 μL van een polymerase kettingreactie (PCR) buffer (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2, en 0,1% Tween), 0,2 μL Taq polymerase, en nuclease-vrije H2O tot een totaal volume van 20 μL. Gebruik de volgende thermocycler-omstandigheden: een smeltstap van 30 s primer bij 95 °C, 30 s anneal bij 64 °C en een 30 s verlenging bij 72 °C, 37 keer herhaald met een laatste 5 min verlenging bij 72 °C.OPMERKING: Dit leverde een productgrootte op van 260 bp voor wildtypemonsters en 292 bp voor monsters die Rpl22-HA+ waren. Cre genotyping uitvoeren met behulp van de volgende primers: forward: 5′ GTGCGCTGAACAACAGGA 3′; reverse: 5′ AGGGACACAGCATTGGAGTC 3′. Bereid de PCR reactie zoals beschreven in stap 2.3.2 gebruik te maken van de Cre primers plaats. Gebruik de volgende thermocycler-omstandigheden: een smeltstap van 30 s primer bij 95 °C, 30 s anneal bij 60 °C en een verlenging van 15 s bij 72 °C, 35 keer herhaald met een laatste 5 min verlenging bij 72 °C. Voer gen van belang genotyping uit zoals standaard voor het gen in kwestie is.OPMERKING: Het genotyping protocol van de auteur maakt gebruik van een geconcentreerde aangepaste Taq,en als zodanig, andere gebruikers kunnen hebben om de voorwaarden aan te passen aan hun enzymatische eisen te wijzigen. Om de impact van het verlies van dit rentegen op de vertaling beter te begrijpen, werden mannetjes die wildtype of homozygous waren voor het gemuteerde allel van belang en die ook Cre+ en Rpl22+ waren geselecteerd om de experimentele monsters te zijn. Genotype selectie wordt verder hierboven besproken in sectie 1. 3. Voorbereiding van oplossingen OPMERKING: Het voorbereiden van oplossingen en alle volgende stappen moeten onder strikte voorwaarden worden uitgevoerd. Voeg 2,5 mL van 1 M Tris pH 7,4, 5 mL van 1 M KCl, 600 μL van 1 M MgCl2en 500 μL NP-40 toe aan een 50 mL-buis. Breng aan de volume (50 mL) in diethylpyrocarbonaat (DEPC) H2O en meng tot alle componenten zijn opgenomen.OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zijn als volgt: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2, en 1% NP-40. Voeg 2,5 mL van 1 M Tris pH 7,4, 15 mL van 1 M KCl, 600 μL van 1 M G.G.2en 500 μL NP-40 toe aan een 50 mL-buis. Breng in de DEPC H2O (50 mL) aan volume en meng tot alle componenten zijn ingebouwd.OPMERKING: De uiteindelijke concentraties zullen als volgt zijn: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2, en 1% NP-40Het protocol kan hier worden onderbroken, en oplossingen kunnen worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot gebruik. 4. Bereiding van weefsel Weeg alle monsterbuizen voor, het registratiegewicht en koel af in vloeibare stikstof. Precool steriele mortel, stamper, en het wegen van spatel op droog ijs. Maal flash-bevroren weefselmonsters tot een fijn poeder met behulp van een voorgekoelde, steriele mortel en stamper op droogijs. Plaats flash bevroren weefsel in voorgekoelde mortel op droogijs. Breek weefsel voorzichtig in grote stukken met behulp van stamper en langzaam malen totdat weefsel is een fijn poeder.OPMERKING: Hoewel vers weefsel ook kan worden gebruikt, volgens het oorspronkelijke protocol13,wordt er geen significant verschil in resultaat waargenomen met het gebruik van flash-bevroren weefsels. Zie representatieve resultaten en discussie voor meer informatie. Breng grondmonster voorzichtig over naar voorgekoelde verzamelbuis door poeder uit mortel te schrapen met behulp van voorgekoelde spatel. Zorg ervoor dat alleen weefsel wordt verzameld en geen vocht op de koude mortel wordt afgezet. Weeg de buis met weefsel, zorg ervoor om op droogijs te houden waar mogelijk. Bereken de massa van het weefsel door het initiële gewicht van de buis af te trekken van het gewicht van de buis met het monster erin. Noteer deze waarde voor latere berekening van lysisbuffervolumes.LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen tot gebruik bij -80 °C worden opgeslagen. 5. Homogenisatie van het monster Bereid lysisbuffer (10 mL HB + supplementen) aan door toevoeging van 10 μL van 1 M dithiothreitol (DTT), 1 proteaseremmertablet, 50 μL RNase-remmer (40.000 eenheden/mL), 200 μL van 5 mg/mL cycloheximide en 100 μL van 100 mg/mL heparine tot 10 mL HB. Meng tot alle componenten zijn opgenomen en houd op ijs tot het gebruik.OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van de supplementen in 10 mL HB zijn als volgt: 1 mM DTT, 200 U/mL RNase-remmer, 100 μg/mL cycloheximide en 1 mg/mL heparine. Deze oplossing moet binnen 24 uur na de toevoeging van de supplementen worden gebruikt en kan tot gebruik bij 4 °C of op ijs worden bewaard. Voeg voor elke 100 mg monster 1 mL lysisbuffer toe. Met dezelfde pipet gebruikt om de lysis buffer toe te voegen, zorgvuldig pipetde de resulterende lysate op en neer om cellen te fragmenteren en mengen. Doorgaan met pipetteren totdat het monster niet langer stroperig is, over het algemeen 25−30 slagen.OPMERKING: Omdat de oplossing in eerste instantie erg stroperig is, moet een pipet met een grote diameter worden gebruikt om de oplossing te mengen. Een standaard 1000 μL is normaal gesproken voldoende voor 100 mg weefsel. Stel monsters op ijs voor 10 min lyse. Draai vervolgens monsters in een voorgekoelde centrifuge (4 °C) gedurende 10 min bij 10.000 x g. Een grote, losse, troebele pellet moet zich vormen in de bodem van de buis. Wees voorzichtig om de pellet niet te verstoren, verzamel het lysaat in een nieuwe buis en neem volume voor elk monster op. Om monsterdegredataie te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de monsters koel blijven gedurende het resterende protocol, waarbij de opslag op ijs of bij 4°C waar mogelijk wordt opgeslagen. 6. Evenwicht van kralen Bereken met behulp van het lysaatvolume uit stap 5.2 het vereiste volume magnetische kralen gekoppeld aan het juiste antilichaambindende eiwit (in dit geval eiwit G). Gebruik voor 1 mL lysaat 375 μL eiwit G-kralen (30 mg/mL).OPMERKING: De keuze van geconjugeerde kralen zal variëren met anti-HA antilichaam gebruikt; Bijvoorbeeld, als een konijn gegenereerdanti-HA antilichaam wordt geselecteerd, eiwit A kralen zal de voorkeur hebben. Verwijder met behulp van een magnetisch buizenrek het kraaloplosmiddel en voeg een even groot volume van verse lysisbuffer toe aan de kralen. Draai 5 min bij 4 °C om te wassen. Voer alle rotatiestappen uit met behulp van een benchtop buis rotater ingesteld op 20 rpm. Plaats de buis op het magnetische buisrek en verwijder de wasbuffer. Herhaal stap 6.1−6.3 nog twee keer. Voeg lysisbuffer toe aan het oorspronkelijke volume om geequilibreerde kralen toe te voegen. Bewaar bij 4 °C of op ijs tot gebruik. 7. Preclearing monster Voeg 50 μL geëquilibreerde kralen voor elke 1 mL lysaat toe aan supernatant van lysed sample (lysaat) en draai bij 4 °C gedurende 1 uur. Leg de buis op het magneetrek en verzamel lysate in een verse buis. Gooi gebruikte kralen weg. Voeg aan het lysaat 25 μL geëquilibreerde kralen toe voor elke 1 mL en draai bij 4 °C gedurende 1 uur. Bewaar resterende geëquilibreerde eiwit G-kralen bij 4 °C ‘s nachts. Plaats de buis op het magneetrek en verzamel lysate in een verse buis. Gooi gebruikte kralen weg. Van het gewiste lysaat behoudt u 50 μL om als monsterinvoerregeling op te treden. Bewaar bij -80 °C.OPMERKING: Het invoermonster fungeert als een controle die de totale RNA-populatie van het monster vertegenwoordigt, inclusief RNA’s die zijn gekoppeld aan andere celtypen in het weefsel, die tijdens downstream-analyses moeten worden gebruikt om te corrigeren voor veranderingen in genexpressie als functie van mutatie. 8. Incubatie van antilichamen Voeg voor elke 1 mL gerooid lysaat 5 μg anti-HA antilichaam toe. Sluit de buisdop af met laboratoriumfolie om monsterverlies te voorkomen. Draai monsters 16−18 h bij 4 °C.OPMERKING: De incubatietijd en concentratie van antilichamen zijn niet geoptimaliseerd. De auteurs vonden een nachtelijke incubatie met 5 μg voldoende; het is echter mogelijk dat een kortere incubatie of minder antilichaam voldoende zal zijn, of dat een langere incubatie of meer antilichaam de binding zal verbeteren. 9. Incubatie van kralen Voeg voor elke 1 mL gerooid lysaat 300 μL eiwit G-kralen toe. Sluit de buisdop opnieuw af met laboratoriumfolie en draai gedurende 2 uur bij 4 °C. 10. Kralen wassen Plaats de monsterbuis op het magneetrek zodat kralen zich kunnen losmaken van iPed lysate. Pipetteer de flow-through lysate en gooi, met behoud van de kralen. Breng 800 μL HSWB aan op kralen en laat 10 min bij 4 °C draaien. Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat kralen scheiden van was. De was verwijderen en weggooien. Breng nog eens 800 μL HSWB aan op kralen. Sluit het monster en laat 5 min bij 4 °C draaien. Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat kralen scheiden van was. De was verwijderen en weggooien. Herhaal stap 10.3 nogmaals. 11. RNA-extractie Plaats de monsterbuis op het magneetrek en laat kralen scheiden van was. Pipetteer weg en gooi wassen, het behoud van kralen voor RNA extractie. Voeg 3,5 μL van 14,2 M bèta-mercaptoethanol (bME) toe aan kralen en meng door vortexing gedurende 15 s. Extract RNA met behulp van een commerciële RNA zuiveringskit, volgens de instructies van de fabrikant. Uitlaten monster in 30 μL RNase gratis H2O.OPMERKING: Hoewel de 10 μL/sample DNase behandeling optioneel is voor de meeste kits, wordt deze sterk aangemoedigd. Deze optionele opruimstap vermindert de achtergrond aanzienlijk, waardoor een nauwkeurigere eindconcentratie mogelijk is. Het is sterk recommened om een kit die bèta-mercaptoethanol (bME) bevat in de lysis buffer te gebruiken. bME fungeert als een extra RNase-remmer om de afbraak van monsters tijdens RNA-isolatie te voorkomen. Bewaar monster bij -80 °C of analyseer onmiddellijk. 12. Kwantificering en steekproefanalyse Met behulp van een UV-Vis spectrofotometer, kwantificeren RNA concentratie en voorlopige kwaliteit. Analyseer de kwaliteit van RNA uit monsters via een bioanalyzer.OPMERKING: Het resulterende RNA kan vervolgens worden gebruikt voor RNA-sequencing of andere downstream-analyses zoals northing blotting of kwantitatieve omgekeerde transcriptie PCR (qRT-PCR).