JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
发育生物学

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Published: March 04, 2020
doi:
10.3791/60927
, ,
1Department of Animal Science,Rutgers University

Summary

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA’nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Abstract

mRNA bolluğundaki farklılıkların ölçülmesi, belirli bir gen mutasyonunun hücre fizyolojisi üzerindeki etkisini anlamak için klasik bir yaklaşımdır. Ancak, translatomdaki farklılıkları (çevrilmiş mRNA’ların tamamı) karakterize etmek, RNA’nın düzenleyici veya bağlayıcı proteinlerin işlevini anlamaya çalışırken özellikle yararlı olan ek bir bilgi katmanı sağlar. Ribozom profilleme ve polizom analizi de dahil olmak üzere, bunu gerçekleştirmek için bir dizi yöntem geliştirilmiştir. Ancak, her iki yöntem önemli teknik zorluklar taşır ve ek sıralama yöntemleri ile kombine edilmedikçe bir doku içinde belirli hücre popülasyonları için uygulanamaz. Buna karşılık, RiboTag yöntemi, uygulanabilir bir hücreye özgü Cre sürücüsü nün mevcut olması koşuluyla, belirli hücre popülasyonlarından ribozom ilişkili RNA’ların belirli hücre popülasyonlarından tanımlanmasına olanak tanıyan genetik tabanlı, verimli ve teknik olarak basit bir alternatiftir. Bu yöntem genetik modeller, numune toplama, immünopresipitasyon ve aşağı RNA analizleri oluşturmak için Üreme oluşur. Burada, yetişkin erkek fare mikrop hücrelerinde erkek doğurganlık için gerekli bir RNA bağlayıcı protein için mutant bu süreci anahat. Verimli koloni yönetimi ve doğru genetik arka plan ve immünopresipitasyon üretimine odaklanarak, arka planı azaltmak ve çıktıyı optimize etmek için ıslah ıslahı için dikkat edilmesi gereken hususlara özel önem verilir. Sorun giderme seçeneklerinin tartışılması, ek onaylayıcı denemeler ve olası alt akış uygulamaları da dahildir. Sunulan genetik araçlar ve moleküler protokoller, mutant fenotiplerin moleküler sürücüleri hakkında bilgi vermek amacıyla karmaşık dokularda veya anormal mRNA depolama ve çeviri sistemlerindeki belirli hücre popülasyonlarının ribozom ilişkili RNA’larını tanımlamak için güçlü bir yolu temsil eder.

Introduction

Bir hücre veya doku RNA bolluğu analizi, mikrodizi veya RNA-sıralama tarafından incelendiğinde, mutant fenotiplerin moleküler sürücüleri anlamak için güçlü bir araç kanıtlamıştır. Ancak, bu nispeten eksik analiz araçları, özellikle nöral ve germ hücreleri gibi çeviriden önce birçok mRNA’nın depolandığı sistemlerde, hücrenin fizyolojisi veya proteomu hakkında bilgi vermeyebilir. Bu sistemlerde, aktif proteine veya hücrenin translatome çevrilen mRNA popülasyonunun tanımlanması, hücrenin gerçek fizyolojik durumunun daha iyi bir göstergesi olabilir1,2. Örneğin, geliştirmenin çeşitli aşamalarındaki mikrop hücreleri, daha sonraki çeviri için depolanan RNA’ları, gelişimsel3 veya sinyal işaretleri tarafından yönlendirilenRNA’larıtranskripsiyonu ile 4. Bu işlem, mRNA kodlama protaminleri ile örneklenir, burada mRNA transkripti protein 1,2,5,6yapilmeden günler önce tespit edilebilir. Aynı şekilde, nöral hücreler rna’yı çekirdekte yazıp aksondan aşağı taşırlar, β-aktin7’deolduğu gibi. Bu özel hücre sistemlerine ek olarak, rna depolama, ribozom biyogenez veya mRNA çevirinin etkilendiği modellerde sabit durumlu transkripsiyonlar bilgilendirici olma olasılığı düşüktür. Birden fazla diğer faktörler de bir hücrenin sabit durum RNA havuzu etkileyebilir mRNA çürüme ve RNA bağlayıcı proteinlerin aktivitesi içerir. Bu gibi durumlarda, ribozomla ilişkili RNA’ları veya mRNA’ları aktif çeviri altında analiz etmek için sağlam araçlar biyolojik olarak ilgili sonuçlar verme olasılığı daha yüksektir.

Bu amaçla, ribozom ilişkili veya etkin olarak çevrilmiş iletileri tanımlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Ribozom ilişkili transkriptlerin anlık görüntüsünü sağlayan polizom profilleme, ribozomal alt birimler veya mono-, di-ve poli-ribozom kompleksleriileilişkili bozulmamış RNA’ları izole etmek için uzun yıllardır kullanılmaktadır 3 . Kısaca, toplanan hücre lisatları doğrusal bir sakaroz gradyan uygulanır ve yüksek hız olarak santrifüj, ribozom alt birimlerin ayrılması ile sonuçlanan, bozulmamış ribozomlar, ve polizomlar boyutuna göre. Geleneksel olarak, bu teknik bir veya birkaç mRNA’yı incelemek için uygulanmıştır, ama son zamanlarda bu yöntem potansiyel çeviridüzenleyicilerinişlevini açıklamak için RNA-seq çalışmaları ile kombine edilmiştir 8,9 Aktif olarak çeviri ve olmayan mRNA’lar arasında ayrım yapmak için güçlü bir yol iken10, polizom profilleme zaman alıcı yöntemler gerektirir (gradyan fraksiyonasyon ve ultracentrifuge) ve nadir hücre analizi yapma iyi bir anlaşma örnek gerektirebilir meydan okuyan nüfuslar.

Translatomu incelemek için alternatif bir yaklaşım ribozom profilleme, doğrudan ribozom ile ilişkili transkript bölümlerini tanımlar. Kısacası, ribozom ilişkili RNA parçaları RNa koruma tsömusu ile oluşturulur, tek tek ribozom kompleksleri sakaroz gradyanı ile ayrılmış, ve ilişkili RNA parçaları izole ve RNA-seq etiketleri dönüştürülür derin sıralama için uygun11. Ribozom profillemenin en önemli faydalarından biri, çeviri başlangıç sitelerinin tanımlanmasına, ribozomal doluluk ve dağılımın hesaplanmasına ve ribozom tezgahlarının 12.000’de tanımlanmasına olanak tanıyan izolasyon sırasında ribozomların belirli konumlarını belirleyebilme yeteneğidir. Ancak, bu yöntem, ekipman ihtiyaçları (degrade fraksiyonu ve ultracentrifuge), kapsamlı sorun giderme gerektiren nispeten karmaşık bir protokol ve deneyimsiz kullanıcı11tarafından kolayca ele alınmayan hesaplama sorunları da dahil olmak üzere çeşitli doğal dezavantajları vardır. Daha da önemlisi, ribozom profilleme öncelikle kültür izole hücrelere uygulanır ve önemli malzeme gerektirir, in vivo sınırlı karışık hücre tipi dokulara veya sıralanmış hücrelere uygulama yapma.

200913yılında Sanz et al. tarafından geliştirilen memeli RiboTag yöntemi, hem polizom hem de ribozom profillemenin doğasında olan bir dizi sorunu ortadan kaldırır. Bu yöntemde, ribozom ilişkili RNA’lar, diğer yöntemlerde gerekli olduğu gibi, ek izolasyon teknikleri ve özel ekipman olmadan karmaşık dokularda hücre tipi spesifik translatomların araştırılmasına olanak sağlayan belirli hücre tiplerinden izole edilebilir13,14. RiboTag yönteminin temeli 60S ribozomal alt birim protein geni Rpl22için modifiye li bir lokus taşıyan transgenik fare modelidir (RiboTag). Bu locus(Rpl22-HA)kodlama bölgesi içinde bir C-terminal hemagglutinin (HA) etiketi içerecek şekilde değiştirilmiş terminal ekson ek bir kopyasını takip floxed terminal ekson içerir. Hücreye özgü Cre Rekombinaz ifade eden bir fareye geçildiğinde, floxed exon, HA etiketli RPL22’nin hücreye özgü bir şekilde ifade edilmesine izin vererek kaldırılır (Şekil 1). HA etiketi daha sonra seçilen hücre tipinden immünoppresipitat (IP) ribozomları ve ilişkili RNA’ları immünoppititate etmek için kullanılabilir.

Tekniği geliştiren ilk yayına ek olarak, riboTag modelini kullanan diğer bazı laboratuvarlar da bu tekniği kullanmaktadır. Fare Sertoli ve Leydig hücreleri15,mikroglia16, nöronlar17,18, oositler19gibi çeşitli dokular ve kültürlü hücreler20 profilli ve incelenmiştir. Bu protokol ribozomları ve ilişkili RNA’ları farklı doku tipleri arasında başarılı bir şekilde izole edebilmesine rağmen, özellikle mutant sistemlere uygulandığında hala iyileştirilmesi gereken alanlar vardır. Özellikle, taze doku yada güven büyük ölçüde analiz gücünü azaltabilir artan teknik varyasyon sonuçları. İkinci olarak, yüksek immünopresidasyon arka plan daha önce bildirilen13olarak non-Cre recombined hücre tiplerinden oluştuğunda farklı çevrilmiş hedeflerin emin kimlik daha zor yapılır. Sanz ve ark. tekniğin temel dayanak noktası nı tasarlarken, bu el yazmasında Snyder laboratuvarı bu endişeleri azaltmak için protokolün optimizasyonunu sunarak yöntemi daha pratik ve verimli hale getirecektir.

Bu makalenin amacı, hücreye özgü HA etiketli ribozomları ifade eden farelerin üremesi, bu ribozomların flash-dondurulmuş örneklerden immünopsipitatedilmesi ve daha fazla downstream analizleri için ilişkili RNA’ların arındırılaması için atılacak adımları açıklamaktır. Memeli erkek germ hücresi ve incelenen kısırlık mutasyonu benzersiz zorluklar sağladığından, bu tekniğin diğer hücre sistemlerine adapte edilebilmektedir yollarını aydınlatmak için çaba gösterilmiştir.

Protocol

Tüm hayvan kullanımı ve işleme uygulamaları Rutgers Üniversitesi’nin Dahili Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Fare ıslahı Erkek kısırlığına yol açan rna bağlayıcı protein mutasyonu için dişi farelerin homozigot ürediği (el yazması, burada ilgi geni olarak anılacaktır) Stra8-iCre alelleri için erkeklerhemizygous üçlü çiftleşmelerinde (B6). FVB-Tg(Stra8-iCre)1Reb/LguJ)(Cre+), her erkeğe iki dişi eşleştirmemiz üreme verimliliğiniartırır.NOT: M için dişihomozigot normal doğurganlık olduğu için, ilgi mutant gen (M) anne tarafından geçirildi. Bu erkek germ hücre Cre baba iletimi izin ek yararı vardır (hemizygous), tavsiye ettiği gibi21 ve istenilen allelik kombinasyonu ile yavruların yüzde optimize. Homozigot Cres germ hücre toksisitesi22sergilediği nden, alelin heterozigot veya hemizygous durumunda muhafaza edilmesi ve geçirilmesi önerilir. Daha da önemlisi, Cre ekspresyonu deneysel popülasyona kadar Rpl22-HA alel ile birlikte oluşmamalıdır. Üreme hayvanlarında Rpl22-HA alelinin Cre’den izole edilmemesi, mikrop hücresi Cre aktivitesi nedeniyle rpl22-HA’yı küresel olarak ifade eden yavrulara neden olacaktır. Bu sorun germ hücresine özgüdür. Ayrıca, Stra8-iCre ilgi yazarların hücre nüfusuna özgüdür22, preleptotenler ve leptotenler de dahil olmak üzere, meyozis içine ve çok erken geçiş hücreleri hedefleyen. İlgi başka bir hücre türüne özgü farklı bir Cre sürücüsü bunun yerine kullanılabilir. Yaygın uygulama erkek germ hücre ifade Cres baba tarafında iletilmesi dikte. Ancak Stra8-iCre’nin anne tarafından bulaşması erkek yavrularda benzer transgen ekspresyonuna neden olabilir. Ne olursa olsun üreme düzeni seçilen, eşdeğer Cre ifadesi ile yavru oluşturmak için, tüm deneysel örnekler aynı ebeveyn tarafında (ya her zaman anne ya da her zaman baba) Cre iletim yoluyla oluşturulmalıdır. Bölüm 2.4’te açıklandığı gibi erkek yavrularına neden olan genotip. M alelvesini taşıyanları ve aşağı akım ıslahı için Cre (+/M:Cre+) pozitif olanları seçin. Rpl22-HA (B6J.129(Cg)-Rpl22tm1.1Psam/SjJ) için erkeklere homozigot üçlü çiftleşmelerde M alelleri için dişi farelerhomozidir.NOT: Rpl22-HA arka planı son derece karışıktır, bu nedenle gerginliğe özgü fenotipleri değerlendirirken dikkatli olunmalıdır. Genotip, M alelini taşıyan ve Rpl22-HA pozitif olanları(+/M:Rpl22-HA+) belirlemek için ortaya çıkan kadın yavruları (bkz. bölüm 2.3). Aşağı üreme için bu dişileri seçin. Çapraz +/M:Cre+ erkek +/M:Rpl22+ üçlü çiftlemelerde dişiler. Ortaya çıkan yavruları (bkz. bölüm 2.3 ve 2.4) hem Cre+ hem de Rpl22+ ve wildtype veya M/M olan erkekleri tanımlamak için genotiplayın.NOT: Bu çalışma tam bir erkek kısırlığı ile sonuçlanan bir mutasyona odaklanArak, istenilen deneysel genotiplerin en verimli şekilde elde edilmesi için üreme planında özel hususlar göz önünde bulundurulmaktadır. Bu tür hususlar diğer deneysel modellerde gereksiz olabilir. Üreme konularının ek tartışması için tam bir üreme şeması ve eşlik eden bir efsane için Şekil 2’ye bakınız. 2. Örnek toplama 21 gün post-partum (dpp) erkek farelerden testistoplamak. Co2 inhalasyonu ile fareleri kurban edin ve ardından servikal çıkış. Her hayvanüzerinde iki daha kısa (2 cm) bağlı yanal kesiler ile çevrili bir ventral kesi (3 cm) yapın. Testisleri ortaya çıkarmak için deriyi ve peritonu geri çekin. Forceps kullanarak, epididim ve testis ortaya çıkarmak için vücut boşluğunun bir tarafında epidymal yağ yastığı çekin. Tenotomi makası ile, testis çıkarmak, epididim uzak kırpmak için özen, yağ çevreleyen, ve herhangi bir dış vaskülatür. 1,7 mL’lik temiz bir tüpe bozulmamış testisleri yerleştirin. Diğer tarafı ile tekrarlayın, ilk tüp ikinci testisleri ekleyerek. Bu tüpü kaplayın ve hemen sıvı nitrojene batırın ve parlama-dondurun.NOT: Numuneler kullanıma kadar -80 °C’de muhafaza edilebilir. Genotipleme onayı için her hayvan için (2 mm) ek kuyruk ucu örnekleri toplayın. DNA ayıklamak için, 1,7 mL’lik bir tüpte 2 mm’lik kuyruk ucuna 50 mM NaOH’un 100 μL’sini ekleyin ve 30 dk için 95 °C’de kaynatın. 100 μL 50 mM HCl ve 20 00 0L 1 M Tris-HCl pH 8,0 ve santrifüj numunelerini 10,000 x g’de3 dk. ekleyin. Süpernatant (genomik DNA içeren) koruyun ve aşağıdaki genotipleme reaksiyonları için şablon olarak kullanılana kadar 4 °C’de çıkarılan DNA’yı saklayın. Aşağıdaki astarları kullanarak Sanz ve ark.13’ten uyarlanmış bir yöntemiz izleyerek Rpl22-HA genotipleme yapın: 5′ GGGAGGCTTGCTGGATG 3′; ters: 5′ TTTCCAGACACAGGCTAAGTACAC 3′. Adım 2.2.1’de çıkarılan 2 μL DNA’dan, 25 mM dNTPs’nin 0.08 μL’inden, 0.1 μL’lik 10 mM ileri astardan oluşan bir reaksiyon karışımı hazırlayın, 0.1 μL 10 mM ters astar, 2 μL polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tampon (650 mM Tris pH = 8,8, 165 mM (NH4)2SO4, 30 mM MgCl2ve %0,1 Tween), 0,2 μL Tak polimeraz ve çekirdeksiz H O2ile toplam 200 000 000 000 000 000 000 000 000 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 0000 000 000 000 00L hacim. Aşağıdaki termocycler koşullarını kullanın: 95 °C’de 30 s astar eritme adımı, 64 °C’de 30 s anneal ve 72 °C’de 30 s uzama, 72 °C’de son 5 dakika uzama ile 37 kez tekrarlanır.NOT: Bu, yabani tip numuneler için 260 bp, Rpl22-HA+ olan numuneler için 292 bp ürün boyutu elde etti. Aşağıdaki astarları kullanarak Cre genotipleme gerçekleştirin: ileri: 5′ GTGCCAGCTGAACAGGA 3′; ters: 5′ AGGGACACAGCATTGGAGTC 3′. Adım 2.3.2 yerine Cre astar kullanarak açıklandığı gibi PCR reaksiyonuhazırlayın. Aşağıdaki termocycler koşullarını kullanın: 95 °C’de 30 s astar eritme adımı, 60 °C’de 30 s anneal ve 72 °C’de 15 s uzama, 72 °C’de son 5 dakika uzama ile 35 kez tekrarlanır. Söz konusu gen için standart olduğu gibi ilgi genotipleme yürütmek.NOT: Yazarın genotipleme protokolü konsantre bir özel Taksaq kullanır ve bu nedenle, diğer kullanıcılar enzimatik gereksinimlerine uyacak şekilde koşulları değiştirmek zorunda kalabilirler. İlgi nin kaybının bu genin çeviri üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için, mutant alelleri için yabani veya homozigot olan ve aynı zamanda Cre+ ve Rpl22+ olan erkekler deneysel numuneler olarak seçilmiştir. Genotip seçimi yukarıda bölüm 1’de daha fazla tartışılmıştır. 3. Çözümlerin hazırlanması NOT: Çözümlerin hazırlanması ve sonraki tüm adımlar sıkı koşullar altında yapılmalıdır. Homojenizasyon tamponu (HB) hazırlamak için 2,5 mL 1 M Tris pH 7,4, 5 mL 1 M KCl, 600 μL 1 M MgCl2ve 500 μL NP-40’ı 50 mL’lik bir tüpe ekleyin. Diethyl pyrocarbonate (DEPC) H2O hacmine (50 mL) getirin ve tüm bileşenler dahil olana kadar karıştırın.NOT: Son konsantrasyonlar aşağıdaki gibi olacaktır: 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2ve %1 NP-40. Yüksek tuz yıkama tamponu (HSWB) hazırlamak için 2,5 mL 1 M Tris pH 7,4, 1 M KCl 15 mL, 1 M MgCl2600 μL ve 500 μL NP-40 ile 50 mL’lik bir tüp ekleyin. DEPC H2O’da hacim (50 mL) getirin ve tüm bileşenler dahil olana kadar karıştırın.NOT: Son konsantrasyonlar aşağıdaki gibi olacaktır: 50 mM Tris pH 7.4, 300 mM KCl, 12 mM MgCl2, ve 1% NP-40Protokol burada duraklatılmış olabilir, ve çözeltiler kullanıma kadar oda sıcaklığında saklanabilir. 4. Doku hazırlanması Sıvı nitrojende tüm numune tüplerini, kayıt ağırlığını ve önceden soğutulma larını önceden tağırlayın. Önceden soğutulan steril harç, havaneli ve kuru buz üzerinde spatula tartma. Kuru buz üzerinde önceden soğutulmuş, steril bir harç ve havaneli kullanarak ince bir toz için flash-dondurulmuş doku örnekleri grind. Kuru buz üzerine önceden soğutulmuş harç içine flaş dondurulmuş doku yerleştirin. Yavaşça pestle kullanarak büyük parçalara doku kırmak ve doku ince bir toz olana kadar yavaş yavaş eziyet.NOT: Taze doku da kullanılabilse de, orijinal protokol13’egöre, flash-frozen dokuların kullanımı ile sonuç olarak anlamlı bir fark gözlenmez. Ayrıntılar için Temsilci Sonuçları ve Tartışma’ya bakın. Zemin numunesini önceden soğutulmuş spatula kullanarak harçtan toz kazıyarak önceden soğutulmuş toplama tüpüne dikkatlice aktarın. Sadece doku toplanır ve soğuk harç üzerine biriken herhangi bir nem emin olun. Mümkün olduğunca kuru buz üzerinde tutmak için özen, doku ile tüp tartın. Tüpün ilk ağırlığını tüpün ağırlığından, içinde örnek olan tüpün ağırlığından çıkararak doku kütlesini hesaplayın. Lysis arabellek birimlerinin daha sonraki hesaplaması için bu değeri kaydedin.NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler kullanıma kadar -80 °C’de saklanabilir. 5. Numunenin homojenizasyonu 10 μL 1 M dithiothreitol (DTT), 1 proteaz inhibitörü tablet ekleyerek lysis tamponu (10 mL HB + takviyeleri) hazırlayın, 50 μL RNase inhibitörü (40.000 birim/mL), 200 μL 5 mg/mL siklohekamid ve 100 μL 100 mg/mL heparin 10 mL HB. Tüm bileşenler biraraya gelip kullanıma kadar buzda tutun.NOT: 10 mL HB’deki takviyelerin son konsantrasyonları aşağıdaki gibi olacaktır: 1 mM DTT, 200 U/mL RNase inhibitörü, 100 μg/mL siklohekamid ve 1 mg/mL heparin. Bu çözelti takviyeleri n 24 saat içinde kullanılmalıdır ve kullanıma kadar 4 °C’de veya buzüzerinde tutulabilir. Her 100 mg numune için 1 mL likis tamponu ekleyin. Lysis tamponu eklemek için kullanılan aynı pipet ile, dikkatlice inerek hücreleri parçalamak ve karıştırmak için yukarı ve aşağı lysate. Numune artık viskoz olmayana kadar pipetleme ye devam edin, genellikle 25−30 vuruş.NOT: Çözelti ilk başta çok viskoz olduğundan, çözeltiyi karıştırmak için büyük çaplı bir pipet kullanılmalıdır. Standart 1000 μL normalde 100 mg doku için yeterlidir. 10 dakika lyse için buz üzerinde örnekleri ayarlayın. Daha sonra, 10 dakika 10 dakika için önceden soğutulmuş santrifüj (4 °C) içinde spin örnekleri 10.000 x g. Tüpün alt kısmında büyük, gevşek, bulutlu bir pelet oluşmalıdır. Pelet rahatsız etmemeye dikkat, yeni bir tüp içine lysate toplamak ve her örnek için hacim kayıt. Numune degredataion önlemek için, numuneler buz üzerinde veya mümkün olduğunca 4 ° C’de depolama, kalan protokol boyunca serin kalmasını sağlamak. 6. Boncuk ların denkliği 5.2. adımdan lysathacmini kullanarak, uygun antikor bağlayıcı proteinle (bu durumda G proteini) birleşen manyetik boncukların gerekli hacmini hesaplayın. 1 mL lysate için 375 μL protein G boncuk (30 mg/mL) kullanın.NOT: Konjuge boncuk seçimi kullanılan anti-HA antikorile değişir; örneğin, tavşan tarafından üretilen bir anti-HA antikor seçilirse, protein A boncuklar tercih edilecektir. Manyetik bir tüp raf kullanarak, boncuk çözücü kaldırın ve boncuklar için taze lysis tampon eşit hacimli ekleyin. Yıkamak için 4 °C’de 5 dk döndürün. 20 rpm olarak ayarlanmış bir tezgah üstü tüp rotater kullanarak tüm dönme adımlarını gerçekleştirin. Tüpü manyetik tüp rafına yerleştirin ve yıkama tamponunu çıkarın. Adımları 6.1−6.3’ün iki kez daha tekrarlayın. Dengedeki boncuklara orijinal ses düzeyine lysis tamponu ekleyin. Kullanıma kadar 4 °C’de veya buz üzerinde saklayın. 7. Ön temizleme numunesi Lysate numunesinin supernatant’ına (lysate) her 1 mL için 50 μL’lik eşitlenmiş boncuk ekleyin ve 4 °C’de 1 saat döndürün. Tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve taze bir tüp içine lysate toplayın. Kullanılmış boncukları atın. Lysate için her 1 mL için 25 μL’lik eşit boncuk ekleyin ve 4 °C’de 1 saat boyunca döndürün. Mıknatıs raf üzerine tüp yerleştirin ve taze bir tüp içine lysate toplamak. Kullanılmış boncukları atın. Temizlenen lysate itibaren, örnek giriş kontrolü olarak hareket etmek için 50 μL tutun. -80 °C’de saklayın.NOT: Giriş örneği, mutasyonun bir fonksiyonu olarak gen ekspresyonu değişikliklerini düzeltmek için alt akım analizleri sırasında kullanılacak, dokudaki diğer hücre tipleri ile ilişkili RNA’lar da dahil olmak üzere, numunenin toplam RNA popülasyonunu temsil eden bir kontrol görevi görür. 8. Antikor kuluçka Temizlenmiş lysate her 1 mL için, anti-HA antikor 5 g ekleyin. Numune kaybını önlemek için tüp kapağını laboratuvar filmi ile kapatın. Numuneleri 16−18 h’yi 4 °C’de döndürün.NOT: Antikor kuluçka süresi ve konsantrasyonu optimize edilmemiştir. Yazarlar yeterli olmak için 5 μg ile bir gecede kuluçka bulundu; ancak, daha kısa bir kuluçka veya daha az antikor yeterli olacağını mümkündür, ya da daha uzun bir kuluçka veya daha fazla antikor bağlayıcılığı artıracaktır. 9. Boncuk kuluçka Temizlenmiş lysate her 1 mL için, protein G boncuk 300 μL ekleyin. Tüp kapağını laboratuvar filmi ile yeniden kapatın ve 4 °C’de 2 saat döndürün. 10. Boncukların yıkanması Örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve boncukların IPed lysate’den ayrılmasını bekleyin. Pipet kapalı akış-lysate ve atmak, boncuk lar istinat. Boncuklara 800 μL HSWB uygulayın ve 4 °C’de 10 dk dönmesini bekleyin. Örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve boncukların yıkamadan ayrılmasına izin verin. Yıkayın ve atın. Boncuklara 800 μL hswb daha uygulayın. Numuneyi kapatın ve 4 °C’de 5 dakika boyunca dönmesini bekleyin. Örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve boncukların yıkamadan ayrılmasına izin verin. Yıkayın ve atın. Adımı bir kez daha tekrarlayın. 11. RNA çıkarma Örnek tüpü mıknatıs rafına yerleştirin ve boncukların yıkamadan ayrılmasına izin verin. Pipet kapalı ve yıkama atın, RNA çıkarma için boncuk istinat. Boncuklara 3,5 μL 14,2 M beta-mercaptoetanol (bME) ekleyin ve 15 s girdap ile karıştırın. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir RNA arıtma kiti kullanarak RNA ayıklayın. 30 μL RNase serbest H2O’da elute numunesi.NOT: 10 μL/örnek DNase tedavisi çoğu kit için isteğe bağlı olsa da, şiddetle teşvik edilmektedir. Bu isteğe bağlı temizleme adımı arka planı önemli ölçüde azaltarak daha doğru bir son konsantrasyon sağlar. Bu güçlü lysis tampon beta-mercaptoetanol (bME) içeren bir kit kullanmak için recommened olduğunu. bME, RNA izolasyonu sırasında numune bozulmasını önlemek için ek bir RNase inhibitörü görevi görür. Numuneyi -80 °C’de saklayın veya hemen analiz edin. 12. Niceleme ve numune analizi UV-Vis spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ve ön kalitesini ölçün. Örneklerden alınan RNA’nın kalitesini bir biyoanalizör aracılığıyla analiz edin.NOT: Ortaya çıkan RNA daha sonra RNA sıralama veya kuzeyle blotlama veya kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) gibi diğer downstream analizleri için kullanılabilir.

Representative Results

Önceki raporlar Cre14eksik hücrelerden non-spesifik immünoprejenite önerdi . Modifiye protokolümüzde durumun böyle olup olmadığını belirlemek için, Hem Cre hem de Rpl22-HA taşıyan hayvanlardan elde edilen örneklerde IP verimi ve cre -driverve Rpl22-HAolmadan immünopsipitated RNA’nın minimal olması beklentisiyle sadece bir tane taşıyan ancak diğerini taşıyan hayvanlardan elde edilen örneklerde IP verimliliği belirlenmiştir. Şekil 3’tegösterildiği gibi, çok az RNA, IP arka planını azaltmak ve orijinal HA etiketli ribozom RNA’ları izole etmek için bu protokolün etkinliğini gösteren Cre veya Rpl22-HA’dan yoksun örneklerden izole edilmiştir. Ayrıca, hem Cre-sadece ve Rpl22-HA-sadece örnekler uygun negatif kontrolleri temsil eder. Reaktif kaynağının IP’nin verimliliğini önemli ölçüde etkileme potansiyeli göz önüne alındığında, Cre ve Rpl22-HA pozitif numunelerde bir dizi antikor ve RNA izolasyon protokolü(Şekil 4)test edildi. Bu sonuçlar, reaktif seçiminin IP verimliliği üzerinde önemli bir etkisi olabileceğini, dolayısıyla reaktif seçiminde yapılacak herhangi bir değişikliğin özenle yapılması gerektiğini göstermektedir. RNA bağlayıcı protein mutantı bağlamında bu protokolü test etmek için wildtype-Cre+Rpl22-HA+ (wildtype) ve ilgi geni-/–Cre+Rpl22-HA+ (İlgi geni-/-) testisleri ribotag ilişkili RNA’yı izole etmek için RiboTag sisteminin etkinliği açısından incelendi ( Şekil5). Wildtype girişi ve IP’nin RNA konsantrasyonu İlgi-/- giriş geni ve IP ile karşılaştırıldığında genotipler arasında anlamlı bir fark görülmedi. Ancak her iki genotip için giriş konsantrasyonu IP konsantrasyonundan önemli ölçüde daha yüksekti ve giriş örneğinde daha fazla RNA olduğunu gösterdi (Şekil 5B). Bu sonuç beklenmektedir, hücrede bulunan tüm mRNA’lar herhangi bir zamanda ribozomile ilişkili olmadığı için, özellikle RNA’ların çevrilmeden çok önce yazıya dönüştürülebileceği mikrop hücrelerinde. Sıralama için gönderilen RNA örneklerinin kalitesini doğrulamak için numuneler biyoanalizör de çalıştırıldı. Normalde 28S ve 18S rRNA zirveleri oranı olarak hesaplanan RNA bütünlük sayıları (RiNs) örnekler arasında karşılaştırıldı. Toplam RNA havuzlarında, RIN değerlerinin daha yüksek RIN ile daha yüksek inferred numune bütünlüğü ve kalitesiyle ilişkili 10’a yakın olması beklenmektedir. IP örnekleri girişlerden daha düşük RIN’e sahip ken, RiN’ler hala kabul edilebilir bir aralıktaydı ve örnek genotiplere bağımlı değildi(Şekil 5C). IPed örnekleri için azaltılmış RIN değerleri, analiz edilen RNA’ların ortalama nükleotit uzunluğundaki nispeten küçük düşüş göz önüne alındığında çok küçük olsa da RNA bozulmasının bir sonucu olabilir. Protokolün uzunluğu ve immünopresid için gerekli sıcaklıklar göz önüne alındığında bazı bozulmalar beklenmektedir. RIN ve RNA uzunluğunun azalması, mRNA’lar gibi rRNA olmayan türler için zenginleştirme işlevi de mümkündür. Şekil 1: RiboTag yöntemi. Yöntemin öncül biyolojik olarak basittir. Orijinal Exon 4’ün Rpl22 locus’u için diziye yeni bir Exon 4 eklenir. Bir Cre sürücüsünün varlığında, orijinal Exon 4’ün her iki tarafındaki loxP siteleri kesilir ve floxed exon’u çıkartır. HA etiketli Exon 4 şimdi Rpl22 mRNA içine dahil, CRE ifade hücrelerde bir HA etiketli RPL22 üreten. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: RiboTag fareler için örnek üreme şeması. Deneysel hayvanlar üretmek için kullanılan üreme şeması gösterilmiştir. İki uçlu bir şema kullanılmıştır. 1. kuşakta iki paralel damızlık üçlüse kurulmuştur. Bir tarafı ilgi alel kombine (erkek kısırlık bu spesifik mutasyon sonuçları olarak annetarafından taşınan) hemizygous Cre ve diğer ilgi alel birleştirerek, yine maternal, Rpl22-HA ile taşınan. Daha sonra, nesil 2, ilgi alel taşıyan ilk eşleştirme erkekler ve Cre ilgi ve Rpl22-HA alel taşıyan ikinci eşleştirme kadın yavruları na geçilir. Ortaya çıkan yavruların genotipleri belirlenir ve deneysel olarak ilgili hayvanlar seçilir (bu durumda cre ve Rpl22-HA alelleri taşıyan yabani tip veya homozigot mutant). Cre-sürücüleriifade germ hücre için dikkat etmek önemlidir, Cre ve Rpl22-HA aleller deneysel nesil kadar birlikte üreme olmamalıdır. Üreme nesillerinde germ hücre ifade Cre Rpl22-HA alel maruz germ hücreli Rpl22-HA eksizyon sürücü olacaktır. Ortaya çıkan herhangi bir yavru küresel olarak Rpl22-HA ifade böylece hücreye özgü ribozom izolasyonu önleyecektir. Burada açıklanan sistemde, genotip başına bir n = 4 downstream analizleri için yeterli istatistiksel güç sağlamıştır. Her deney sistemi için biyolojik çoğaltma numarası belirlenmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Negatif kontrollerin teyidi. Cre+ ve Rpl22-HA+ olan örnekler, tek başına Cre+ veya Rpl22-HA+ olan örneklere göre daha yüksek RNA çekme gösterir. Cre+ ve Rpl22-HA+ numunesi RNA çekme etkinliği arasında önemli bir fark yoktur, bu da Cre veya Rpl22-HA’dan yoksun örneklerin uygun negatif kontroller olduğunu gösterir. “+” bu örneklerde karşılık gelen alel veya transgenin bulunduğunu ve “-” olduğunu gösterir. IP/giriş, RNA immünopsipitated (IP) toplamı (giriş) RNA’ya oranını temsil eder. Nanogramkonsantrasyonundan hesaplanan değer. ** p < 0025'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Reaktifler protokol başarısını etkiler. (A) Flash dondurulmuş doku, taze dokuya benzer immünopremitasyon verimliliği ile sonuçlanır. (B) İki ticari antikor için IP verimi belirlendi, Antikor 1 ve Antikor 2(Malzeme Tablosu)olarak belirlenmiştir. Test edildiğinde, Antikor 1 negatif (Cre veya Rpl22-HA+) ve pozitif kontroller (cre ve Rpl22-HA+ifade etmek değil) ayırt etmek mümkün olduğu ortaya çıktı Antikor 2 daha RNA aşağı çekerek daha etkili oldu. Tek tek biyolojik kopyalar için IPed ve giriş RNA oranının göstergesi olan nokta. (C) RNA ekstraksiyon kitleri(Malzeme Tablosu)karşılaştırıldığında, Kit 2 önemli ölçüde Kit 1’den daha iyi performans gösterdi. Her iki kit de negatif kontrollerden benzer miktarda RNA çıkarmış olsa da, Kit 2 pozitif örneklerden önemli ölçüde daha yüksek RNA verimi elde etti. * p < 0,05, ** p < 0,025, *** p < 0,01 gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Yöntemin mutant bir modele uygulanması. (A) İlgi proteini genine karşı özel bir şirket içi antikor kullanarak Batı lekeleme yoluyla ilgi genotip onayı örnek Gen ilgi Gen gösterir -/- (M / M) erkekler ilişkili protein üretmek için başarısız. GAPDH yükleme kontrolü olarak gösterilmiştir. (B) Wildtype ve mutant numuneler için eşleştirilmiş giriş ve IPed örneklerinden grafikbiyoanalizör çıkışı. (C) RNA bütünlük sayılarını (RIN) örnek türüne ve genotipine göre karşılaştırma. (D) Biyoanalizör tarafından örnek tip ve genotip tarafından analiz edilen RNA türlerinin ortalama nükleotit uzunluğu. * p < 0.05, ** p < 0.025, *** p < 0.01, N.S. önemli değil gösterir. Genotip başına N = 4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Cre sürücü onayı örneği. Germ hücre gelişiminde(Stra8)erken çevrilmiş bir genin niceliği ve germ hücre gelişiminde geç çevrilen iki gen(Tnp1 ve Prm1)RNA immünomunomu qRT-PCR tarafından analiz edilen RPL22-HA iki farklı germ hücre Crestarafından tahrik , Stra8-iCre (germ hücre gelişiminde erken ifade) ve Hspa2-Cre (daha sonra germ hücre gelişiminde ifade, özellikle stra8 sonra) tarafından. Burada, STRA8 HA-IP erken germ hücreli Cre sürücü ile elde edilir ama daha sonra germ hücreli Cre sürücü immünopresipitenasyon hücre özgüllüğünü gösteren ile değil. Buna karşılık, geç germ hücrelerinde tercüme transkript HA-IP stra8-iCre ve Hspa2-Crehem de elde edilir. Bu, Stra8-iCre’ı ifade eden hücrelerin, gelişimlerinin tamamı boyunca HA-etiketli RPL22’yi oluşturması beklenirken, Hspa2-Cre’yi ifade edenler bunu sadece gelişimlerinin sonraki bölümlerinde yapacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Belirli bir hücre türünün translatomanlamak daha doğru normal veya mutant durumda bir hücrenin fizyolojisi anlamak için paha biçilmezdir. Çevirinin transkripsiyondan çok uzak olduğu nöral dokuda veya transkripsiyonun çeviriden çok önce gerçekleştiği mikrop hücrelerinde olduğu gibi transkripsiyondan ayrı kalınan sistemlerde özel fayda görülür. Translatome analizi diğer yöntemlere göre, RiboTag sisteminin en büyük avantajı Cre rekombinaz sisteminin kullanımı ndan gelir. Bu, ilgili bir Cre sürücüsü olan herhangi bir hücre popülasyonuna hedefleme özgürlüğü sağlar. İkinci olarak, RiboTag IP burada açıklandığı gibi etkili ve çok daha az teknik olarak zorlu ve zaman alıcı ya polizom veya ribozom profilleme daha. Son olarak, RiboTag IP kolayca tezgah kısmında yapılabilir.

Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. Bunların başında RiboTag fare hattının kurulması ve inceleþtirilmeleri için deneysel hayvanlarýn nesli yer alıyor. Tüm genetik modellerde olduğu gibi fare kolonisi içindeki bireylerin dikkatli takibi ve dikkatli genotipleme protokolleri uygulanmalıdır. Sanz ve ark. başına PCR genotipleme wildtype alel (260 bp) ve mutant (290 bp)13ayırt etmek için wildtype exon 4 loxP site 5′ hedefleyen astar içermelidir. Germ hücre modellerinde RiboTag analizi durumunda, çok özel üreme gereksinimlerine uyulmalıdır. İlk olarak, kısırlık la sonuçlanan mutantlar söz konusu olduğunda, düşünceli üreme stratejileri orta ve deneysel nesillerde istenilen genotip ile yavru sayısını optimize etmek için yöntemler içermelidir. İkinci olarak, germ hücre spesifik Cresdurumunda , bakım Creile ilgili alınmalıdır -zigosity Cre toksisite mikrop hücrelerinin duyarlılığı verilen. Germ hücrede, Cre protein yüksek düzeyde zararlı etkileri olabilir22, üreme düzeninde Cre / Cre hayvanların kullanımını yasaklayan. Son olarak, germ hücre Cres kullanırken, bir ara nesil germ hücresinde Cre ifade olarak son nesil kadar Cre ribuTag alel izole etmek önemlidir yavrular rpl22-HA küresel ifade neden olacaktır.

Hücre sisteminden bağımsız olarak, hem Cre ifadesinin sağlamlığını hem de özgüllüğünü doğrulamak için önerilen bir dizi denetim mümkündür. Kre’nizin doğru ekspresyonu ve Beklenen Rpl22-HA eksizyonu birden fazla yöntem kullanılarak belirlenebilir. İlk olarak, deneysel hayvanlardan izole doku HA için immünohistokimya veya immünoresans15kullanılarak boyanabilir. Bu yöntem, hedef hücre türlerinde çevrilmiş mRNA’lar hakkında priori bilgisi gerektirmemesi açısından en uygun yöntemdir. İkinci yöntem, örnek olarak Şekil 6’dagösterilmiştir, hedef hücre türlerinde çeviri olarak düzenlenmiş iletiler hakkında bilgi gerektirir. Bu yöntemde, bilinen bir çeviri yle düzenlenmiş mRNA için zenginleştirme, IPed’in nicel PCR’si ve giriş RNA’sını kullanarak seçilen Cre-driver’dan doğrulanabilir. Aynı şekilde, sağlam Rpl22-HA ekspresyonu, etkili negatif kontroller olarak hareket eden Cre+/Rpl22+ veya Cre+/Rpl22 örnekleri ile Cre+/Rpl22+ örneklerinin (pozitif kontroller) karşılaştırılmasıyla doğrulanabilir (Bkz. Şekil 3). Bu karşılaştırmalar ya toplam IPed RNA veya qRT-PCR veya başka bir nicel yöntem tarafından değerlendirilen bilinen bir çeviri düzenlenmiş mRNA için zenginleştirme yapılabilir.

Protokolün yürütülmesinde karşılaşılan sık karşılaşılan sorunlar, yalnızca RNA verimi beklenmedik şekilde düşük veya yüksek olduğunda belirginleşir. Bu başarısızlıkların en yaygın nedeni bireylerin yanlış genotipleme kaynaklarından kaynaklanmasıdır. Beklenmeyen RNA verimleri durumunda tüm numunelerin genotiplerini doğrulamak için toplanan numuneden ek doku elde etmeyi öneririz. Onaylandıktan sonra, RNase kontaminasyonu veya numune bozulması olasılığı da dahil olmak üzere diğer olasılıklar göz önünde bulundurulmalıdır. Laboratuvar içinde RNase serbest bölgelerinin dikkatli numune depolamave işleme ve bakımı bu sorunları büyük ölçüde azaltabilir veya ortadan kaldırabilir. RNA yalıtım sorunları bu protokoldeki bir diğer potansiyel sorun olsa da, ticari kitlerin kullanımı bu sorunu büyük ölçüde azaltır, ancak rnase ücretsiz olarak muhafaza edildiklerinden ve süresi dolmuş çözümler içermediğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Son olarak, tüm antikor tabanlı prosedürlerde olduğu gibi, lot varyasyonları, depolama koşulları, konsantrasyon, hatta nakliye olumsuz antikor kalitesini ve pulldown sonraki başarısını etkileme potansiyeline sahip. Sonuç olarak, dikkatli ve tekrarlanan testlerin ardından, mevcut en tutarlı ve verimli antikorseçtik.

Bu protokol, başarı olasılığını önemli ölçüde artıran diğer yayınlanmış RiboTag protokollerine göre iki önemli değişiklik içerir. Bir flaş dondurulmuş doku kullanma yeteneği, bu nedenle çok, teknisyen veya teknik çalışma varyasyonları içeren herhangi bir sorunları hafifletici. Örnekler toplanabilir ve ha-ribozomların tüm örneklerden aynı anda izole edilmesine izin vererek, önemli varyasyon kaynakları olabilecek leri azaltabilir. İkinci olarak, önceden açık adımın eklenmesi, RiboTag sisteminin diğer kullanıcıları tarafından bildirilen arka plan türüne önemli ölçüde neden olabilir. Son zamanlarda, Sanz ve ark. tarafından bir protokol raporu olmayanCre-tahriklihücrelerin ribozom ilişkili transkript bolluğu nedeniyle yüksek arka plan varlığını gösterir14. Protokolümüz bu sorunu bir ön temizleme adımı ekleyerek gidererek, Cre negatif IP örneklerinde RNA varlığını etkin bir şekilde ortadan kaldırır.

Tüm sistemler gibi RiboTag sisteminin de doğal sınırlamaları akılda tutulmalıdır. Tanımsız Cre sürücüleri kullanırken, deneysel numune üretiminden önce ifade analizi yapılmalıdır. Çeviri açısından bakıldığında, bu yöntemin çeşitli nüansları unutulmamalıdır. İlk olarak, RiboTag çevirmek için hazır mRNA’lar ve aktif olarak çeviri yapanlar arasında ayrıma izin vermez. Bu nedenle, mevcut RiboTag tabanlı yöntemler, çeviri verimliliğinin tek tek mRNA’ların bir fonksiyonu olarak ölçülmesine izin vermez. Çeviri verimliliği ilgi çekiciyse, RiboTag yöntemi polizom profilleme gibi diğer translatom analiz araçlarıyla birleştirilirse, hücreye özgü olarak ölçülebilir. İkinci olarak, bireysel veya genotip bağımlı varyans kaynaklanan toplam RNA bolluk değişiklikleri dikkate almak esastır. Bu nedenle, giriş RNA’sının dikkatli izolasyonu immünopresipitasyona ve her birinden alınan numunelere herhangi bir downstream analizi boyunca eşleştirilmiş olarak eşlik eder. Son olarak, riboTag tabanlı analiz açısından, bir ribozom ile ilişki mutlaka çeviri meydana geldiğini kanıtlamak değildir unutulmamalıdır. İlgi çekici hedeflerde çeviri düzenlemesini onaylamak için ikincil analiz yöntemleri uygulanmalıdır.

Bu protokol, RiboTag modelini kullanarak erkek farelerin mikrop hücrelerinden ribozom ilişkili RNA’ların izolasyonuna açıklanmaktadır. Fare ıslahı ve örnek toplama için muhasebe değil, protokol iki gün sürer, ilk gün üç saat, en iyi öğleden sonra yapılır, bir gecede kuluçka, sonraki sabah çalışma beş saat takip. Stok çözeltilerinin (HB ve HSWB) hazırlanmasının yanı sıra doku öğütmenin önceden yapılması önemle tavsiye edilir. Protokolün genel başarısı doğru genotipleme ve sıkı RNase-free koşullara bağlıdır. Belirli hücre tiplerinin translatomını inceleme yeteneği, gelecekteki çalışmaların transkripsiyon, çeviri ve sayısız hücre tiplerinde ve mutant arka planlardaki proteom arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamalarını sağlayacaktır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibe NICHD R00HD 083521 tarafından EMS ve Rutgers Üniversitesi’nden EMS iç destek finanse edilmiştir.

Materials

1 mL mechanical pipette Preference of researcher
1,4-Dithio-DL-threitol (8% Alfa Aesar A15797
1.7 mL or 2mL tubes Preference of researcher
10 mL conical tubes Preference of researcher
10 mL serological pippettes Preference of researcher
10 uL mechanical pipette Preference of researcher
20 uL mechanical pipette Preference of researcher
200 uL mechanical pipette Preference of researcher
5 mL serological pipettes Preference of researcher
50 mL conical tubes Preference of researcher
Anti-HA tag antibody Abcam ab18181 Antibody 1
Anti-HA tag antibody Antibodies.com A85278 Antibody 2
B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ Mice The Jackson Laboratory 17490 Or mice carrying Cre driver of choice
B6N.129-Rpl22tm1.1Psam/J Mice The Jackson Laboratory 11029
Benchtop centrifuge Preference of researcher
C1000 Touch thermal cycler BioRad 184-1100 Or equivalent thermal cycler
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000537 Or equivalent refrigerated centrifuge
Cyclohexamide Sigma Aldrich C7698-1g
Dissection scissors Preference of researcher
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen by ThermoFisher Scientific 10009D
DynaMag-2 Magnet rack Invitrogen by ThermoFisher Scientific 12321D
E.Z.N.A. Total RNA Kit 1 OMEGA 6834-01 Kit 1
Heat block Preference of researcher
Heparin Sigma Aldrich 84020
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272-500g
Microdissection forceps Preference of researcher
Microdissection scissors Preference of researcher
MiRNeasy kit Qiagen 217004 Kit 2
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi ThermoFisher Scientific ND-ONE-W Or equivalent spectrophotometer
NP-40 Alternative – CAS 9016-45-9 – Calbiochem Millipore Sigma 492016
Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free ThermoFisher Scientific A32965
Potassium (KCl) Sigma Aldrich P3911-2.5kg
RNase Inhibitor, Murine New England BioLabs Inc. M0314
SI vortex-genie 2 Scientific Industries SI-0236 Or equivalent benchtop vortex
Tips for 1 mL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 10 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 20 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tips for 200 uL mechanical pipette Preference of researcher
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) ThermoFisher Scientific BP152-500
Tube Revolver / Rotator ThermoFisher Scientific 88881001 Or equivalent rotator
VWR Powerpette Plus pipet controller VWR 75856-450 Or equivalent pipette controller
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snyder, E. M., et al. Gene expression in the efferent ducts, epididymis, and vas deferens during embryonic development of the mouse. Developmental Dynamics. 239 (9), 2479-2491 (2010).
  2. Snyder, E. M., Small, C. L., Li, Y., Griswold, M. D. Regulation of gene expression by estrogen and testosterone in the proximal mouse reproductive tract. Biology of Reproduction. 81 (4), 707-716 (2009).
  3. Iguchi, N., Tobias, J. W., Hecht, N. B. Expression profiling reveals meiotic male germ cell mRNAs that are translationally up- and down-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 103 (20), 7712-7717 (2006).
  4. Busada, J. T., et al. Retinoic acid regulates Kit translation during spermatogonial differentiation in the mouse. 发育生物学. 397 (1), 140-149 (2015).
  5. Kleene, K. Patterns of translational regulation in the mammalian testis. Molecular Reproduction and Development. 43 (2), 268-281 (1996).
  6. Mali, P., et al. Stage-specific expression of nucleoprotein mRNAs during rat and mouse spermiogenesis. Reproduction Fertilility and Development. 1 (4), 369-382 (1989).
  7. Steward, O., Schuman, E. M. Protein synthesis at synaptic sites on dendrites. Annual Review of Neuroscience. 24, 299-325 (2001).
  8. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  9. Snyder, E., et al. Compound Heterozygosity for Y Box Proteins Causes Sterility Due to Loss of Translational Repression. PLoS Genetics. 11 (12), 1005690 (2015).
  10. Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. Polysome Profiling Analysis of mRNA and Associated Proteins Engaged in Translation. Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79 (2019).
  11. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods. 126, 112-129 (2017).
  12. Aeschimann, F., Xiong, J., Arnold, A., Dieterich, C., Grosshans, H. Transcriptome-wide measurement of ribosomal occupancy by ribosome profiling. Methods. 85, 75-89 (2015).
  13. Sanz, E., et al. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  14. Sanz, E., Bean, J. C., Carey, D. P., Quintana, A., McKnight, G. S. RiboTag: Ribosomal Tagging Strategy to Analyze Cell-Type-Specific mRNA Expression In Vivo. Current Protocols in Neuroscience. 88 (1), 77 (2019).
  15. Sanz, E., et al. RiboTag analysis of actively translated mRNAs in Sertoli and Leydig cells in vivo. PLoS One. 8 (6), 66179 (2013).
  16. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  17. Ceolin, L., et al. Cell Type-Specific mRNA Dysregulation in Hippocampal CA1 Pyramidal Neurons of the Fragile X Syndrome Mouse Model. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 340 (2017).
  18. Puighermanal, E., et al. drd2-cre:ribotag mouse line unravels the possible diversity of dopamine d2 receptor-expressing cells of the dorsal mouse hippocampus. Hippocampus. 25 (7), 858-875 (2015).
  19. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes and Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  20. Lesiak, A. J., Brodsky, M., Neumaier, J. F. RiboTag is a flexible tool for measuring the translational state of targeted cells in heterogeneous cell cultures. Biotechniques. 58 (6), 308-317 (2015).
  21. The Jackson Laboratory. . B6.FVB-Tg(Stra8-icre)1Reb/LguJ. , (2019).
  22. Bao, J., Ma, H. Y., Schuster, A., Lin, Y. M., Yan, W. Incomplete cre-mediated excision leads to phenotypic differences between Stra8-iCre; Mov10l1(lox/lox) and Stra8-iCre; Mov10l1(lox/Delta) mice. Genesis. 51 (7), 481-490 (2013).

Tags

RiboTagImmunoprecipitationGerm CellsMale MouseRNA ExtractionHomogenization BufferHigh-salt Wash BufferLysis Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chukrallah, L. G., Seltzer, K., Snyder, E. M. RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse. J. Vis. Exp. (157), e60927, doi:10.3791/60927 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image